Генетическая гетерогенность лекарственно-резистентных штаммов M. tuberculosis, циркулирующих на территории Томской области

20.04.2007

О.В. Воронкова1, В.В. Новицкий1, О.И. Уразова1, С.И. Татьков2, А.Ю. Сивков2, Е.А. Рябова1, Р.Р. Хасанова1

1 ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Томск

2 ФГУП «ГНЦ ВБ «Вектор», Новосибирская область, пос. Кольцово

Введение

Туберкулез в России является исключительно важной медико-социальной проблемой. Среди причин эпидемиологического неблагополучия по этому заболеванию можно выделить несколько основных: низкий уровень жизни большей части населения, растущее число эмигрантов из неблагополучных по туберкулезу стран ближнего зарубежья и лиц без определенного места жительства, увеличение циркуляции штаммов M. tuberculosis, устойчивых к противотуберкулезным препаратам[1 - 5, 11, 13, 25].

Необходимые звенья борьбы с распространением возбудителя туберкулеза - ранняя диагностика и эффективное лечение болезни с выявлением контактов с носителями инфекции [12, 14, 15, 21].

К сожалению, основные эпидемиологические показатели по туберкулезу в Западной Сибири всегда превышали общероссийские в среднем на 20%, что, вероятно, связано с более тяжелыми природными и социально-экономическими условиями, а также с большой концентрацией пенитенциарных учреждений, эффективный контроль над туберкулезом в которых стал действенно осуществляться лишь с 2000 года [7, 10, 20, 23].

Несмотря на достаточное лабораторно-техни-ческое оснащение противотуберкулезных учреждений Томской области, позволяющее осуществлять качественный мониторинг основных эпидемиологических показателей, методы молекулярно-гене-тической эпидемиологии здесь до настоящего времени не применялись. Между тем известно, что генетическая структура и физико-химические особенности штамма M. tuberculosis формируют основу его вирулентности (патогенности) - основного видового признака [29]. До середины 90-х годов прошлого века отсутствовали надежные методы изучения геномной гетерогенности популяции M. tuberculosis, определения ареалов возбудителя, расшифровки путей передачи и механизмов формирования эпидемически опасных мульти- и полирезистентных штаммов, контроля эффективности лечения [19, 29].

Большинство методов молекулярной эпидемиологии основано на использовании в качестве маркеров повторяющихся последовательностей нуклеотидов в ДНК M. tuberculosis, таких как IS - инсерционные элементы и короткие повторы [18, 24, 26, 27]. Анализ распределения таких видоспецифичных нуклеотидных последовательностей в геномах различных изолятов микобакте-рий позволяет установить их сходство или различие, определить родственные (идентичные) штаммы, а сопоставление данных генотипирования возбудителя и результатов эпидемиологических исследований позволяет выявить особенности эпидемиологической обстановки на каждой отдельной территории.

Целью настоящего исследования являлась оценка генетической гетерогенности лекарственно-резистентных штаммов M. tuberculosis, циркулирующих на территории г. Томска и Томской области.

Материалы и методы

С сентября 2004 по июнь 2005 года M. tuberculosis были изолированы из мокроты больных туберкулезом легких (ТЛ), культивировались на средах Левенштейна-Йенсена и Финн-2 в бактериологической лаборатории Томского областного противотуберкулезного диспансера. Методом абсолютных концентраций определялась устойчивость штаммов к основным противотуберкулезным препаратам. В исследование были включены штаммы, имеющие устойчивость как минимум к двум препаратам одновременно - изониазиду и рифампицину. Для изучения геномного полиморфизма M. tuberculosis случайным образом были отобраны 99 лекарственно-устойчивых клинических изолятов возбудителя, которые в инактивиро-ванном виде доставлялись в лабораторию молекулярной биологии туберкулеза ГНЦ ВБ «Вектор» (поселок Кольцово Новосибирской области), где устойчивость M. tuberculosis к рифампицину подтверждалась биочиповым методом детекции мутаций в гене rpoB (ТВ-биочип (RIF), разработка лаборатории А.Д. Мирзабекова Института молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта, Москва). Типирование M. tuberculosis проводилось методом MIRU-VNTR-анализа с использованием основных генных локусов, содержащих различное количество тандемных повторов (VNTR) в качестве маркера микобактериального генома. MIRU-генотипирова-ние осуществляли, используя 12 пар праймеров для амплификации локусов микобактериального генома: MIRU - 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40.

ПЦР проводили в объеме 10 мкл, содержащем: 5-50 нг ДНК, с использованием буфера (60 мМ трис-HCl, рН 8,5, 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон X-100, 10 мМ меркаптоэтанола), 0,2 мМ дНТФ, 0,2 мкМ растворов праймеров и 0,5 ед. акт. Taq-полимеразы на амплификаторе «БИС-110» (без масла) с начальной денатурацией при 94 °С -4 мин, далее - 34 цикла с денатурацией при 94 °С - 30 с, отжигом праймеров при 55 °C - 20 с и элонгацией при 72 °С - 1,5 мин и заключительной элонгацией при 72 °С - 5 мин [24]. Аликвоты амплификатов фракционировали в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия в трис-аце-татном буферном растворе в течение 45 мин при100 В.