Генетическая гетерогенность лекарственно-резистентных штаммов M. tuberculosis, циркулирующих на территории Томской области

20.04.2007

Обработку полученной электрофореграммы и оцифровку длин получаемых полос производили с помощью программы GelAnalysis, пакета GelExplorer. Длины полос ампликонов подтверждали их положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам (100 п.н. - маркер). Построение дендрограммы проводили путем оцифровки длин полученных ампликонов с помощью программы BioNumerics (Applied Math, США).

Для оценки тяжести и характера течения специфического процесса, вызванного определенным генотипом возбудителя, проводилось анкетирование пациентов, изучение карт диспансерного наблюдения и историй болезни каждого пациента, из мокроты которых были выделены M. tuberculosis для генотипирования. Кроме этого, оценивались социальные и медико-биологические факторы риска, характер, течение и исходы туберкулезного процесса. Нами были разработаны тематические карты оценки факторов, предрасполагающих к развитию туберкулеза легких с множественной лекарственной устойчивостью, а также карты для оценки тяжести течения туберкулеза легких на фоне терапии. Среди факторов риска учитывались: возраст пациента, социальный статус, наличие в анамнезе контакта с больным туберкулезом, факты выезда за пределы постоянного места жительства за год до заболевания, нахождение в местах лишения свободы, наличие вредных условий труда, наблюдение у психиатра или нарколога, злоупотребление алкоголем, стаж курения, наличие хронических заболеваний.

Для оценки тяжести течения и эффективности лечения туберкулеза легких принимали во внимание: давность туберкулезного процесса, клиническую форму инфекции, распространенность специфического процесса в легких, осложнения основного процесса, характер осложнений, нарушение функции внешнего дыхания; динамику изменений в процессе противотуберкулезной химиотерапии клинической картины заболевания, функции внешнего дыхания, характер изменений рентгенологической картины, длительность интенсивной фазы специфической противотуберкулезной химиотерапии и применения препаратов II ряда, срок абацил-лирования, общий срок лечения. Регистрировались также факты отклонения от курса химиотерапии. Для оценки частоты встречаемости качественных признаков использовали метод множественного сравнения с помощью критерия Х-квадрат Пирсона (Statistica, версия 5.0).

Результаты и обсуждение

Наиболее популярным в мире методом гено-типирования M. tuberculosis являются метод ДНК-фингерпринтинга и RFLP-анализ, основанный на изучении количества и особенностей расположения в микобактериальном геноме IS6110 [18, 24, 27, 28]. Данный метод хорошо зарекомендовал себя и широко используется в России [6, 8, 9, 17, 18]. Исследователями было установлено, что если степень сходства генома отдельных штаммов по RFLP-профилю составляет не менее 60%, то такие штаммы можно считать близкородственными.

Проанализировав полученные результаты MIRU-генотипирования M. tuberculosis, мы установили, что 99 протипированных нами штаммов обладают значительным генетическим сходством, степень родства которых, рассчитанная с помощью программы BioNumerics, составила 93%. На рисунке 1 представлена дендрограмма кластеризации, отражающая степень генетического родства штаммов (слева) и схематическое цветовое компьютерное изображение VNTR-пат-тернов (справа) M. tuberculosis. Анализ дендро-граммы позволил выявить четыре крупные ветви (кластера), условно обозначенные нами буквами A, B, C и D. Штаммы, входящие в каждый из четыре кластеров, имели еще более высокую степень генетического родства: так, объединенные в кластер А различались между собой менее чем на 5%, штаммы кластера В - менее чем на 4%, кластера С - менее чем на 5,5%, кластера D - менее чем на 8%.

В целом у 99 исследованных штаммов нам удалось выявить 47 различных VNTR-профилей, из которых 34 были уникальными (т.е. представленными в единственном экземпляре), а остальные 13 (в их составе 55 изолятов) имели идентичные VNTR-паттерны, состоящие из 2 - 18 штаммов. Таким образом, показатель кластерности генотипов составил 65,66%.

Территориальное происхождение исследованных штаммов M. tuberculosis представлено в таблице 1.

Дендрограмма кластеризации M. tuberculosis (по результатам MIRU-VNTR-типирования 99 клиническихизолятов)

Рисунок 1. Дендрограмма кластеризации M. tuberculosis (по результатам MIRU-VNTR-типирования 99 клиническихизолятов)