Некоторые характеристики процесса получения препаратов рестриктаз EcoRI, BamHI, Bglll, PstI, Pmil и использование рестриктаз Pmil и PstI для изучения хромосомных ДНК из менингококков

20.04.2007

И.Э. Борисова, В.А. Юркив

ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва

Изучение характера гидролиза хромосомных ДНК из патогенных штаммов микроорганизмов с помощью рестрикционных эндонуклеаз имеет важное значение для эпидемиологического анализа патогенных бактерий. Поскольку менин-гококковая инфекция еще встречается в виде эпидемий в разных странах мира, изучение штаммов Neisseria meningitidis, осуществленное с помощью рестрикционного анализа хромосомных ДНК, позволит усовершенствовать эпидемиологический надзор за возбудителем менингококковой инфекции и профилактику менингококковой инфекции.

Специфические эндонуклеазы (рестриктазы) II класса применяются для картирования генома различных микроорганизмов, расшифровки первичной структуры ДНК, выделения индивидуальных генов и конструирования гибридных молекул.

Целью настоящего исследования стало описание некоторых характеристик методов очистки, предложенных для рестриктаз EcoRI, BamHI, BglII, PstI, PmiI [1, 2, 4], и использование рестриктаз PmiI и PstI для изучения хромосомных ДНК менингококков.

Материалы и методы

Для выделения специфических эндонуклеаз были использованы штаммы-продуценты Escherichia coli (K-12 1100 NM182), Bacillus amyloliquefaciens HI, Bacillus globigii, Providencia stuartii, Proteus mirabilis 1667. Хромосомные ДНК менингококков были выделены из клеток Neisseria meningitidis. Штаммы N. meningitidis (восемь штаммов) были выделены как возбудители менингококковой инфекции, один штамм не вызывал инфекции. Для очистки рестрик-таз использовали коммерческие Р-11-фосфоцел-люлозу (Whatman, Великобритания), DE-52-целлюло-зу (Whatman, Великобритания), голубую сефарозу (Pharmacia, Швеция) и некоторые широко употребляемые реактивы. Для тестирования препаратов рестриктаз была использована ДНК фага X.

Культивирование штаммов-продуцентов рест-риктаз проводили методом глубинного культивирования с использованием отечественных питательных сред (бульона Хоттингера, мясопептонного бульона).

Выделение препаратов хромосомных ДНК из штаммов N. meningitidis осуществляли по модифицированному методу Мармура [9].

Обработку ДНК специфическими эндонукле-азами проводили в течение 1 - 3 часов в присутствии 1 - 10 единиц активности фермента на 0,5 - 5 мкг ДНК. Объем пробы составлял 20 -200 мкл. При гидролизе использовали инкубационные среды, предложенные Грином и соавт. [8], Боливаром и соавт. [6]. Электрофоретический анализ препаратов ДНК проводили в блоках 0,8 - 1,4%-ного агарозного геля на трисацетат-ном буфере [6].

Результаты и обсуждение

В ранее проведенных исследованиях Н.В. Цветковой и соавт. предложена схема очистки для рестриктаз EcoRI и BamHI [4]. Процесс очистки включал следующие этапы:

  1. разрушение микробных клеток;
  2. удаление нуклеиновых кислот 10%-ным раствором сульфата стрептомицина;
  3. удаление балластных белков (двухступенчатое фракционирование сульфатом аммония);
  4. ионообменная хроматография на Р-11-фосфо-целлюлозе (использование градиента NаСl);
  5. концентрирование препаратов рестриктаз на DE-52-целлюлозе и против буфера с глицерином.

В данном исследовании охарактеризован процесс очистки с использованием рисунка 1, на котором представлен хроматографический профиль элюции на Р-11-фосфоцеллюлозе диализата, содержащего рестриктазу ЕсоЯ! (пики, соответствующие проскоку и промывке, на рисунке не показаны). На рисунке 2 представлена электрофоре-тическая картина разделения фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК фага X посредством фракций из градиента. Специфическая активность была обнаружена во фракциях с 15-й по 55-ю, что соответствовало молярности NaCI 0,4 - 0,6 М. Максимальное поглощение при 280 нм на хрома-тографическом пике соответствовало 20-й фракции. Значение этого поглощения было близко к величине 2,0 по оптической плотности. Активные фракции объединяли. Тотальный объем созданного пула активных фракций концентрировали на DE-52-целлюлозе для повышения стабильности фермента EcoRI при хранении. Специфическая активность была обнаружена во фракциях с 1-й по 4-ю. Фракции, содержащие рестриктазу EraRI, объединяли и дополнительно концентрировали против буфера с глицерином. На рисунке 3 представлен хроматографический профиль элюции на Р-11-фос-фоцеллюлозе диализата, содержащего рестрикта-зу BamHI (пики, соответствующие проскоку и промывке, на рисунке не показаны). Специфическая активность была обнаружена во фракциях с 5-й по 25-ю. Этим фракциям соответствовала моляр-ность NaCI 0,25 - 0,46 М. Максимальное значение поглощения при 280 нм соответствовало 12-й фракции. Значение этого поглощения было близко величине 1,3 по оптической плотности. Активные фракции объединяли. Тотальный объем созданного пула активных фракций концентрировали на DE-52-целлюлозе для повышения стабильности фермента BamHI при хранении. Специфическая активность была обнаружена во фракциях со 2-й по 6-ю. Фракции, содержавшие рестриктазу BamHI, объединяли и дополнительно концентрировали против буфера с глицерином. Данный метод позволил получить препараты рестриктаз EcoRI и BamHI, специфически фрагментирующие ДНК фага X и не содержащие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.