Некоторые характеристики процесса получения препаратов рестриктаз EcoRI, BamHI, Bglll, PstI, Pmil и использование рестриктаз Pmil и PstI для изучения хромосомных ДНК из менингококков

20.04.2007
Специфическая активность (EcoRI) во фракциях градиента (хроматография на Р-11-фосфоцеллюлозе)

Рисунок 2. Специфическая активность (EcoRI) во фракциях градиента (хроматография на Р-11-фосфоцеллюлозе)

Хроматографический профиль элюции с Р-11-фосфоцеллюлозы (очистка рестриктазы EcoRI)

Рисунок 1. Хроматографический профиль элюции с Р-11-фосфоцеллюлозы (очистка рестриктазы EcoRI)

Хроматографический профиль элюции с Р-11-фосфоцеллюлозы (очистка рестриктазы BamHI)

Рисунок 3. Хроматографический профиль элюции с Р-11-фосфоцеллюлозы (очистка рестриктазы BamHI)

Хроматографический профиль элюции с голубой сефарозы (очистка рестриктазы BglII)

Рисунок 4. Хроматографический профиль элюции с голубой сефарозы (очистка рестриктазы BglII)

В ранее проведенных исследованиях И.Э. Семина предложила схему очистки рестриктазы BglII на аффинном сорбенте - голубая сефароза [2]. На рисунке 4 представлен хроматографический профиль элюции на ней супернатанта, содержащего рестриктазу BglII. Специфическая эндонуклеаза BglII элюировалась во фракциях с 23-й по 40-ю. Этим фракциям соответствовала молярность NaCl 0,2 - 0,4 М. Препарат рестриктазы BglII после очистки вполне пригоден для физического картирования ДНК. В предложенном методе отсутствовали стадии осаждения сульфатом стрептомицина, фракционирования сульфатом аммония, процессы диализа. Метод являлся простым и технологичным и мог использоваться для мелкосерийного производства препаратов некоторых ферментов рестрикции. Одностадийную хроматографию на голубой сефарозе применяли Дж. Чирикьян, а также К. Бакси с соавт. для получения препаратов рест-риктаз HinfI и ВагпН!, не содержащих неспецифических нуклеаз [7, 5]. В экспериментах, проведенных ранее И.Э. Семиной, по выделению рестрикта-зы PstI из биомассы Providencia stuartii, собранной в начале стационарной фазы роста, не получилось удалить значительную часть неспецифических нук-леаз при фракционировании на голубой сефарозе супернатанта, содержавшего рестриктазу РstI [2]. Для дополнительной очистки применили ионообменную хроматографию на Р-11-фосфоцеллюлозе [2]. Такая же схема, как для PstI, была использована Н.Л. Бахом и соавт. для очистки рестрик-тазы PmiI из штамма Proteus mirabilis 1667 [1]. Двухстадийная очистка на голубой сефарозе и Р-11-фосфоцеллюлозе позволила получить препараты рестриктаз BglII, PstI и PmiI, нe содержащие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.