Некоторые характеристики процесса получения препаратов рестриктаз EcoRI, BamHI, Bglll, PstI, Pmil и использование рестриктаз Pmil и PstI для изучения хромосомных ДНК из менингококков

20.04.2007

Рестриктазы PmiI и PstI были использованы для гидролиза препаратов хромосомных ДНК, выделенных из различных штаммов менингококков. При гидролизе рестриктазой PmiI препаратов хромосомных ДНК из штаммов-возбудителей менингококковой инфекции образовалось значительное количество рестрикционных фрагментов с различными молекулярными массами. Электро-форетическая картина разделения фрагментов, образовавшихся после гидролиза с помощью рестриктазы PmiI хромосомной ДНК из штамма, не вызывающего инфекции, представляла картину частичного гидролиза при значительной степени недогидролиза. В треке 10 представлена картина стандартного гидролиза ДНК фага X рестриктазой PmiI. Характер гидролиза указывал на наличие высокой активности у рестриктазы РплИ. Рестриктаза PstI практически не гидроли-зовала ни один из исследованных препаратов хромосомных ДНК. В треке 20 представлена картина гидролиза препарата хромосомной ДНК из штамма Bordetella pertussis 305 с помощью рес-триктазы PstI. Характер гидролиза указывал на наличие высокой активности у рестриктазы PstI. Рестриктазы, полученные по схемам Н.В. Цветковой и соавт., И.Э. Семиной, Н.Л. Баха и соавт. [4, 2, 1], были использованы для изучения характера гидролиза хромосомной ДНК из штамма Bordetella pertussis 305 [3]. В данной работе рестриктазы, полученные по этим схемам, были использованы для изучения хромосомных ДНК менингококков. Таким образом, следует предположить, что рестрикционный анализ хромосомных ДНК может быть применен для установления различий между патогенными и непатогенными штаммами микроорганизмов и для изучения детерминант вирулентности. Для рестрикцион-ного анализа необходимы препараты рестриктаз достаточной степени чистоты. Схемы, описанные в данной работе, могут использоваться для получения препаратов рестриктаз, пригодных для исследований хромосомных ДНК патогенных и непатогенных штаммов микроорганизмов, а также для исследований препаратов ДНК другого типа. Дальнейшие исследования, направленные на усовершенствование схем очистки рестрик-таз, позволят разработать новые, сокращенные технологичные схемы, с помощью которых исследователи будут выделять и очищать рестриктазы, пригодные для рестрикционного анализа различных препаратов ДНК.

Выводы

  1. При гидролизе с помощью рестриктазы PmiI препаратов хромосомных ДНК из восьми штаммов возбудителей менингококковой инфекции образуется набор значительного числа рестрикцион-ных фрагментов с различными молекулярными массами.
  2. Рестриктаза PstI не гидролизует препараты хромосомных ДНК, полученные из различных штаммов менингококков.

Summary

Two schemes of the purification of restriction endonuclease EcoRI, BamHI, BglII, PstI and PmiI are presented. Chromatographic profiles of the elution of restriction endonucleases EcoRI, BamHI and BglII are presented and are described. Restriction endonucleases PmiI and PstI were used for the study of chromosomal DNAs of meningococci. The results suggested that the preparations of restriction endonucleases, which have neccessary level of the purification, may be use for the study of the differences between pathogenic strains and nonpathogenic strains of microorganisms.

Литература

  1. Бах Н.Л., Цветкова Н.В., Семина И.Э. и др. Выделение и очистка рес-трикционной эндонуклеазы Pmil из штамма Proteus mirabilis 1667. -Антибиотики и медицинская биотехнология. 1985. Т. XXX, № 5. С. 342, 343.
  2. Семина И.Э. Оптимизация процесса получения препаратов рестрик-таз и их использование для клонирования ДНК Bordetella pertussis: Дис. ... к.б.н. - М., 1982.
  3. Семина И.Э., Цветкова Н.В., 1араев М.М. Изучение ДНК возбудителя коклюша Bordetella pertussis // ЖМЭИ. 1982. № 7. C. 65 - 68.
  4. Цветкова Н.В., Жданова Л.Г., Грубер И.М. и др. Выделение и очистка бактериальных эндонуклеаз // Тезисы Ill Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических препаратов. - Рига, 1979. С. 89 - 90.
  5. Baksi K., Rogerson D.L., Rushizky C.W. Rapid, single-step purification of restriction endonucleases on Cibacron Blue F3GA-agarose // Biochemistry, 1978. V. 17. № 20. P. 4136 - 4139.
  6. Bolivar F., Rodrihuez R., Betlach M. et al. Construction of new vehicles. I Ampicilin-resistance derivatives of the plasmid pMB9 // Gene, 1977.V. 2. P. 75 - 93.
  7. George J., Chirikjian G. Biospecific fractionation matricks for sequence specific endonuclease // Nucleic Acids Research. 1978. V. 5. № 7.P. 2223 - 2232.
  8. Green P.J., Heyneker H.L., Bolivar F. et al. General method for purification of restriction endonucleases // Nucleic Acids Research. 1978. V. 5, 7. P. 2373 – 2380.
  9. Marmur J. A procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // Journal of Molecular Biology. 1961. V. 3. P. 208 - 218.