Выделение, генотипирование и анализ полной нуклеотидной последовательности сибирского изолята вируса паротита

18.10.2007

А.П. Агафонов1, А.А. Неверов1, С.Н. Каменева1, Д.В. Сараев1, З.И. Гинько2, В.М. Блинов1, К.М. Чумаков3, Г.М. Игнатьев1, В.В. Зверев4

1 ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, пос. Кольцово, Новосибирская область

2 Новосибирский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями

3 Center for biologics evaluation and research, food and drug administration, USA

4 НИИ вирусных препаратов, Москва

До недавнего времени эпидемический паротит (свинка) был широко распространен в мире: в среднем от 0,1 до 1% (в некоторых странах до 6%) населения переболевало этой болезнью. Она и сегодня остается одной из распространенных вирусных респираторных детских инфекций, и происходит это главным образом потому, что менее 40% стран мира используют вакцину для плановой профилактики данного заболевания. Болезнь регистрируется чаще всего у детей и, хотя и протекает в основном с умеренными клиническими проявлениями, иногда может вызывать осложнения в виде менингита (3 - 6% случаев), энцефалита (около 0,26% случаев, однако 1,4 % из них заканчиваются летальным исходом), панкреатита (3 - 4% случаев) и орхита (20 - 30% случаев у мужского населения) [4, 10, 12].

Возбудитель заболевания - вирус паротита - относится к семейству Paramyxoviridae, роду Rubulavirus, и содержит одноцепочечную отрицательную РНК, кодирующую четыре коровых белка (V/P, L и NP), два поверхностных гликопротеина (HN и F), матриксный белок (M) и SH-белок, который, как предполагают, является мембран-ассоци-ированным [6, 7, 11]. В настоящее время выделяют 11 генотипов вируса паротита. Генотипирование основано на анализе последовательности SH-гена, который отличается наибольшей вариабельностью по сравнению с другими районами генома вируса [2, 16, 17]. Известно, что под «давлением» иммунной системы вирус способен изменять свои антигенные и патогенные характеристики. По этой причине анализ циркулирующих на отдельной территории изолятов может предоставить информацию об изменениях в геноме вируса и возможных путях его эволюции.

В 1994 году при изучении вспышки эпидемического паротита в поселке Кольцово Новосибирской области был выделен изолят вируса паротита, штамм «Драгун» [1]. Штамм относился к генотипу С [5]. Полная нуклеотидная последовательность штамма была расшифрована в 2004 году и находится в базе данных GenBank (№ AY669145, авторы: А.А. Неверов, А.П. Агафонов, С.Н. Каменева, Г.М. Игнатьев, К.М. Чумаков, http://www.ncbi.nlm. nih.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=50404164).

Работа посвящена выделению, генотипирова-нию, изучению иммунобиологических свойств и анализу первичной нуклеотидной и аминокислотной последовательности структурных генов изолята вируса паротита, выделенного в 2003 году в г. Новосибирске.

Материалы и методы

Вирус. В качестве референс-штамма был использован штамм «Эндерс» вируса паротита, полученный из Американской коллекции клеточных культур (ATCC, штамм «Эндерс» № 14D, VR-106,92.02). Штамм прошел три пассажа на культуре клеток Vero.

Культуры клеток и питательные среды.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ по культивированию вирусов семейства Paramyxoviridae [18] работа по выделению изолята вируса паротита проводилась на культуре клеток почки обезьяны Vero, полученной из коллекции культур клеток ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» (пос. Кольцово Новосибирской области). Клетки культивировались с использованием среды ДМЭМ производства ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор», содержащей 2%-ные сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (Gibco Laboratories, Grand Island, NY), 2 мМ L-глутамина и антибиотики (бензилпенициллин Na - 100 ЕД/мл и стрептомицина сульфат - 100 мкг/мл).

Выделение изолята вируса паротита от больного. У больного с клиническим диагнозом «эпидемический паротит» через семь суток после появления клинических признаков заболевания (повышение температуры, увеличение слюнных желез) забрали носоглоточный смыв. Пробы поместили в 1 мл среды ДМЭМ, фильтровали через фильтры 0,45 мкм (ф. Millipore, США) и вносили в пенициллиновые флаконы с монослоем клеток Vero. Флаконы инкубировали при 36 0С в течение шести суток. Для поддержания роста клеток использовали среду ДМЕМ с добавлением 2%-ной сыворотки плодов крупного рогатого скота и антибиотиков. После одного слепого пассажа культуральной вируссодержащей жидкостью (КВЖ) из флакона заражали монослой клеток Vero в культуральных флаконах (25 см2, Sigma, Cat № C017775) и инкубировали при 36 оС, наблюдая за характером изменения монослоя.