Выделение, генотипирование и анализ полной нуклеотидной последовательности сибирского изолята вируса паротита

18.10.2007

Серологические методы. Сыворотки от больного забирали на 7-е, 11-е, 14-е сутки и отдаленную - через 165 дней после появления клинических признаков заболевания. Сыворотки были исследованы на наличие противопаротитных антител в РТГА и ИФА. Анализ сывороток на наличие антител классов IgG и IgM проводили методом ИФА с использованием тест-системы Enzygnost Anti-Parotitis-Virus/IgG и Enzygnost Anti-Parotitis-Virus/IgM (Dade Behring, Германия) в соответствии с инструкцией по применению тест-системы. РТГА проводили по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Macaca mulatta.

Диагностическая ОТ-ПЦР (обратно-транс-криптазная полимеразная цепная реакция). Длямолекулярно-биологического подтверждения диагноза «эпидемический паротит» из проб носоглоточного смыва с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (ф. QIAGEN, Германия) выделяли РНК, после этого проводили ПЦР с использованием набора AmpliTaq (ф. Elmer Perkin, США) на амплификаторе Eppendorf (Eppendorf, США), используя праймеры и условия, описанные ранее [1]. Продукты ОТ-ПЦР анализировали в 1,5%-ном агарозном геле.

Определение полной нуклеотидной последовательности структурных белков вируса проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems Prism 310 с использованием AB1 prism Big Dye terminator V3.1 cycle набора для сиквенса. Для секвенирования использовали продукты амплификации, как описано ранее [14].

Выравнивание производилось с помощью программы AS [13], графики плотности распределения мутаций были построены в программе MegaGene [3].

Филогенетический анализ осуществлялся с помощью программного обеспечения MEGA3 (методом NJ Neighbor-Joining) [9]. Расчет структуры вариабельности штаммов производили используя новую компьютерную технологию GigaGene [15].

Для удобства анализа и сравнения все известные штаммы вируса паротита, у которых расшифрованы полные последовательности генома, были обозначены в соответствии со следующей кодировкой: 1 - генотип, 2 - страна выделения, 3 - год выделения, 4 - сокращенное название штамма, 5 - номер деривата штамма (если имеется несколько дериватов одного штамма), Х - неизвестно (табл. 1).

Этические нормы. Исследование проводили с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.1993 г. № 2288, федеральные законы № 30-ФЗ от 2.03.1998 г., № 214-ФЗ от 20.12.1999 г.). Опрос больного и взятие крови проводили после получения письменного информированного согласия. Порядок проведения исследования одобрен этическим комитетом (IRB00001360).

Результаты и обсуждение

Больной (возраст - 17 лет) поступил в Новосибирский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями (пос. Кольцово Новосибирской области) с клиническим диагнозом «эпидемический паротит средней степени тяжести». Изучение истории больного показало, что заболевание началось с появления насморка, кашля с мокротой, болей в горле и подъема температуры тела до 37,8 оС. Первичный диагноз - ОРВИ. Температура слабо снижалась анальгетиками, и через трое суток больной вновь обратился в поликлинику. В это время уже наблюдалась припухлость слюнных желез. Больной был отправлен для стационарного лечения дома. Еще через трое суток были зарегистрированы резкое увеличение околоушных слюнных желез, озноб, рвота, общая слабость, боли при глотании, головные боли. При осмотре зафиксированы увеличение подчелюстных лимфоузлов до 3 х 3, болезненность околоушных слюнных желез, ригидность затылочных мышц, повышение температуры тела до 39,9 оС. Больной был госпитализирован через семь суток после появления первых признаков заболевания. Основные биохимические показатели крови и мочи не отклонялись от нормы на протяжении всего срока лечения. На третьи сутки лечения наблюдалось увеличение СОЭ до 30 мм/ч. Температура под действием анальгетиков была стабилизирована и не повышалась более 37,0 оС.

После девяти суток нахождения в стационаре больной был выписан в удовлетворительном состоянии.

Изучение его анамнеза не выявило иммуноде-фицитных или хронических заболеваний. Больной был вакцинирован против эпидемического паротита в полтора года.

Образцы носоглоточного смыва и первая сыворотка были получены спустя семь суток после появления клинических признаков заболевания. Полученным от больного образцом была заражена культура клеток Vero. Кроме этого, для подтверждения клинического диагноза «эпидемический паротит» сыворотки были изучены на присутствие специфических антител класса IgM, а из образцов от больного была выделена РНК и проведена реакция ОТ-ПЦР. Антитела к вирусу паротита класса IgM были обнаружены в двух сыворотках из трех, полученных на ранних сроках заболевания (табл. 2).