Выделение, генотипирование и анализ полной нуклеотидной последовательности сибирского изолята вируса паротита

18.10.2007

Результаты ПРЦ-анализа подтвердили наличие РНК вируса паротита в смывах с носоглотки больного. Следует отметить также, что антитела класса IgG находились в момент измерения на высоком уровне. После одного пассажа на клетках Vero были отмечены изменения монослоя, характеризующиеся появлением гигантских многоядерных клеток (симпластов). Таким образом, клинический диагноз «эпидемический паротит» был подтвержден лабо-раторно: в сыворотке крови больного были обнаружены антитела класса IgM, содержание антител класса IgG в парных сыворотках возрастало, у больного методом ОТ-ПЦР была обнаружена РНК вируса паротита и от больного выделен вирус этой инфекции.

Для проведения работ по генотипированию выделенного изолята продукт ПЦР из образца носоглоточного смыва был секвенирован. Генотипический анализ показал принадлежность к генотипу Н (рис. 2а). Для изучения возможных изменений в геноме вируса, вызвавших тяжелое течение инфекции и столь длительную циркуляцию вируса в организме больного, из зараженной культуры клеток Vero (3-й пассаж вируса от исходного, выделенного из носоглотки больного) была выделена РНК в достаточном для проведения работ по секвенированию количестве. После секвенирова-ния было произведено нуклеотидное выравнивание и построен график плотности распределения мутаций для 16-ти полных геномов относительно штамма «ПетроНов» (рис. 1). На рисунке 1 четко видно, что изученные геномы распределились по последовательностям на три группы. В первую группу попадает штамм «ПетроНов» и наиболее близкий к нему штамм HUSXX881, другая группа, наиболее далекая по отношению к названным, представлена тремя вакцинными штаммами Jeryl Lynn (AUS64Jl1, AUS64Jl2, AUS64Jl3), остальные 12 штаммов образуют третью, промежуточную группу. Следует отметить, что точки пересечения кривых для этих трех групп отсутствуют, что говорит об отсутствии явных рекомбинационных механизмов для исследованных штаммов вируса паротита.

Филогенетический анализ, как для полных геномов в целом, так и отдельно для каждого гена, показал, что между дикими и вакцинными штаммами явных отличий нет. С незначительными перестановками внутри подгрупп деревья для всех генов были схожи и практически повторяют дерево для полного генома (рис. 2б). Тем не менее интересно отметить, что филогенетическое дерево отдельно для М-гена отличается от деревьев для всех других генов: штамм «ПетроНов» попадает в подгруппу вакцинных штаммов А-генотипа, а описанный ранее авторами штамм «Драгун» по М-гену наиболее близок к вакцинному штамму AUS64Jl2(рис. 2в). В настоящее время принято геноти-пировать изоляты вируса паротита по наиболее вариабельному фрагменту генома (см. рис. 1), включающему С-концевую часть гена F и SH-ген. Выделенный нами изолят относился к генотипу Н (см. рис. 2а). Для отнесения выделенного изолята к этому генотипу были использованы референс-штаммы, предложенные в работе Jin L. и соавт. [8].

Электронная микрофотография вируса эпидемического паротита, х250 000

Рисунок 1. Электронная микрофотография вируса эпидемического паротита, х250 000

Филогенетические деревья для изученных последовательностей вируса паротита (а - по SH-гену, б - по полным нуклеотидным последовательностям генома, в - по М-гену)

Рисунок 2. Филогенетические деревья для изученных последовательностей вируса паротита (а - по SH-гену, б - по полным нуклеотидным последовательностям генома, в - по М-гену)