Лабораторная характеристика ослабленных вариантов отечественных штаммов вируса краснухи, адаптированных к культуре клеток Vero

10.08.2008

Другая линия клеток Vero из Европейской коллекции клеточных культур ВОЗ (Женева, Швейцария) была предоставлена для работы ФГУП «НПО «Микроген».

Эти клетки выращивали в питательной среде ДМЭМ, содержащей 7% прогретой фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ФС КРС); зараженные вирусом клетки культивировали в поддерживающей среде с 1% ФС КРС.

Перевиваемую линию клеток почек кролика RK-13, используемую для изучения инфекционной активности вируса краснухи, культивировали в питательной или поддерживающей среде RPMI-1640, содержащей 7 или 1% прогретой ФС КРС соответственно. Во все среды добавляли гентамицин в концентрации 50 мкг/мл. Культуры выращивали при 35 оС.

Пассирование вируса краснухи. Вирус пассировали в культурах клеток, взятых на 3 - 4-й день роста. Слой клеток перед заражением трижды ополаскивали раствором Хэнкса рН 7,5. Адсорбцию вируса проводили при 35 оС в течение 2-х часов. Затем во флаконы с инфицированными клетками вносили поддерживающую среду и инкубировали при 35 оС. ВСМ из зараженных культур пассировали через 5 - 9 дней.

Титрование вируса. ВСМ титровали в культуре клеток RK-13 методом бляшек под агаровой средой в нашей модификации [4]. Культуру, выращенную во флаконах объемом 50 мл, заражали на 3 - 4-е сутки после засева, когда был сформирован однородный по плотности слой клеток. Десятикратные разведения ВСМ в поддерживающей среде вносили по 1 мл на флакон. После адсорбции в течение 2-х часов при 35 оС жидкость из флаконов удаляли и пласт клеток покрывали средой, приготовленной на растворе Эрла, содержащей 1,5% агара Дифко, 0,22 г соды, 2,8% аминопептида и 0,6 мг/мл протаминсульфата. На 5 - 7-е сутки инкубации при 35 оС клетки окрашивали, наслаивая агаровую среду такого же состава, но содержащую 0,005% нейтрального красного. Результаты учитывали на 6 - 10-е сутки после заражения.

Титры вируса определяли по цитопатическому действию на клетки RK-13. Пробирки со сплошным слоем клеток на 3 - 4-й день роста ополаскивали раствором Хэнкса и заражали десятикратными разведениями ВСМ, которые вносили по 1,0 мл на пробирку (четыре пробирки на разведение). Культуры инкубировали при 35 оС. Результаты учитывали на 9-й и 15-й день после заражения.

Реакцию нейтрализации испытанных штаммов вируса краснухи ставили с использованием метода бляшек. Вируссодержащую жидкость (доза вируса 200 - 350 БОЕ/мл) смешивали в равных объемах с иммунной сывороткой, разведенной 1:8 и инкубировали в течение часа при комнатной температуре. Затем по 1 мл этой смеси вносили в культуру клеток RK-13. После 2-х часов инкубации при 35 оС инокулят удаляли и клетки покрывали агаровой средой. Учет бляшек проводили ежедневно в течение недели после окрашивания. Одномоментно ставили опыты с заведомо известным вирусом краснухи, а также с неимунной сывороткой и контролировали испытуемые сыворотки на цитотоксичность.

Реакцию гемагглютинации (РГА) и реакцию торможения гемагглютинации антигена вируса краснухи осуществляли макрометодом в объеме 0,6 мл при использовании глюкозо-желатиново-верона-лового буферного раствора с 0,1% сывороточным альбумином КРС (V фракция), гемагглютинирующе-го антигена в дозе, равной 4 гемагглютинирующим единицам (ГЕ), и эритроцитов голубей по методике, описанной ранее [18, 3].

Антигенные свойства разных штаммов вируса краснухи изучали в иммунологическом маркерном тесте на кроликах [13]. Иммунизировали самок кроликов породы «шиншилла» весом 1,5 - 2,0 кг.

Каждый штамм, полученный на разных пассажных уровнях в культуре клеток Vero, испытывался на двух группах кроликов, каждая из которых насчитывала трех животных. Одной группе ВСМ вводили однократно по 1,0 мл внутривенно, другой - по 0,5 мл в каждую ноздрю (всего 1,0 мл на животное). Пробы крови брали перед иммунизацией, через каждую неделю в течение первого месяца и через две - четыре недели в последующие второй и третий месяцы. Сыворотки крови исследовали в РТГА с антигеном вируса краснухи.