Циркуляция на территории Томской области M. tuberculosis генетического семейства Beijing

10.08.2008

Цель исследования: оценить генетическую гетерогенность клинических изолятов М. tuberculosis и выявить распространенность генотипа Beijing в Томской области.

Было исследовано 42 клинических изолята М. tuberculosis, полученных от больных в возрасте от 20 до 70 лет с первично диагностированным инфильтративным туберкулезом легких, проживающих на территории Томской области. Диагноз туберкулеза легких устанавливали на основании клинической картины заболевания, рентгенологического исследования легких, данных микроскопического и бактериологического исследования мокроты. Для видовой идентификации M. tuberculosis и определения чувствительности возбудителя к противотуберкулезным химиопрепаратам (методом абсолютных концентраций) производили посев мокроты на плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2.

MIRU-генотипирование осуществляли используя 12 пар праймеров для амплификации локусов микобактериального генома: MIRU 2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, 40. ПЦР проводили в объеме 10 мкл, содержащем 5 - 50 нг ДНК и буфер следующего состава: 60 мМ трис-HCl, рН 8,5, 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1% тритон X-100, 10 мМ меркапто-этанол; 0,2 мМ дНТФ, 0,2 мкМ растворы праймеров и 0,5 ед. акт. Taq-полимеразы, на амплификаторе «БИС-110» (без масла) с начальной денатурацией при 94 °С 4 мин, далее - 34 цикла с денатурацией при 94 °С 30 с, отжигом праймеров при 55 °C 20 с, элонгацией при 72 °С 1,5 мин и заключительной элонгацией при 72 °С 5 мин. Аликвоты амплифи-катов фракционировали в 2% агарозном геле в присутствии бромистого этидия в трис-ацетатном буферном растворе в течение 45 мин при 100 В. Полученную электрофореграмму фотографировали в УФ, число прямых повторов в локусах определяли с помощью программы Quantity one (версия 4.3.1, BioRad). Кластерный анализ М. tuberculosis проводили с помощью программы BioNumerics (Applied Math, США). Дендрограмму рассчитывали с применением категориального коэффициента подобия методом UPGMA-невзвешенного попарного арифметического среднего.

Результаты и обсуждение

На рисунке 1 представлены дендрограмма кластеризации, отражающая степень генетического родства штаммов (слева), и схематическое изображение VNTR-паттернов (справа) с указанием номера клинического изолята по лабораторному журналу. Доля лекарственно-устойчивых изолятов в этой выборке составляла 36% (с моно- и полирезистентностью - пять штаммов, с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) - десять изолятов), лекарственно-чувствительных - 64% (табл. 1).

Как следует из рисунка, выборка штаммов представлена двумя ветвями А и В. Ветвь В - малочисленная, неоднородная, на ее долю приходится 17% штаммов. Средняя степень гомологии в ней равняется 70%, три штамма идентичны по MIRU и образуют кластер. Ветвь А доминирует в выборке, на ее долю приходится 83% всех изолятов. Однако она также неоднородна: 94% всех штаммов составляют две группы - А1.1 и А1.2; на долю группы А1.1 приходится 74% штаммов ветви А, на долю группы А1.2 - 20%.

В группе А1.1 выделены две достаточно однородные подгруппы, обозначенные А1.1.1 и А1.1.2. В подгруппе А1.1.1 выявлено два немногочисленных кластера идентичных изолятов. Из них первый (изоляты 863 и 877) представлен одинаковым штаммом M. tuberculosis, выделенным от одного и того же больного с интервалом в месяц. Второй кластер (изоляты 853 и 871) также образован изо-лятами, выделенными от одного и того же больного, но с промежутком в три месяца.