Генетическое разнообразие вируса гепатита В на территории Республики Саха (Якутия)

20.10.2008

Материалы и методы

Материалом для выделения ДНК вируса ГВ служила сыворотка крови пациентов с хроническим гепатитом В. Образцы сыворотки крови хранились при минус 20 оС до момента исследования. Вирусную ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови производства ООО НПФ «Литех», Москва (Россия), согласно инструкции производителя. Детекцию вирусной ДНК ГВ осуществляли методом «гнездовой» ПЦР в сыворотках крови, положительных на HBsAg или на анти-HBc, с помощью двух пар праймеров: S1-1, S1-2; S2-1, S2-2 [7].

Генотипирование и изучение гетерогенности 16 изолятов ВГВ проводили с использованием участка преS1/преS2/S-генов. С этой целью проведена амплификация фрагментов генома ВГВ, соответствующих преS1/преS2/S-генам, методом «гнездовой» ПЦР в сыворотках крови, положительных на ДНК ВГВ. Выбор данной области для изучения генетических свойств выделенных изо-лятов был продиктован тем, что на этом участке расположены структурные гены вируса, анализ которых наиболее информативен в филогенетических исследованиях, и тем, что эти гены кодируют оболочечные белки вируса, изменения в которых влияют на детекцию HBsAg с помощью иммуноферментных тест-систем. Для получения ПЦР-фрагментов, соответствующих преS1/ преS2/S-генам, на матрице ДНК каждого изо-лята был амплифицирован участок длиной 1562 н.о. с праймерами 2805F (2805 - 2827) и 1208R (1208 - 1192), а также 2817F (2817 - 2836) и 1197R (1197 - 1174) - позиции праймеров указаны для изолята AJ344117. Используемые при этом праймеры были разработаны нами с помощью пакета программ DNASTAR V 5.00 (Lasergene, Inc., США) по выровненным нуклеотидным последовательностям различных изолятов вируса гепатита В, представленных в базе данных DDBJ/ EMBL/GenBank (DNA Data Bank of Japan, Mishima, Япония; EMBL - Nucleotide Sequence Database, Cambridge, Великобритания; GenBank - NCBI,

Bethesda, MD, США). Секвенирование фрагментов было проведено с использованием праймеров 2817F, 323R (323 - 303) и 242F (242 - 264) и набора Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit, согласно инструкции производителя на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 DNA sequencer (Applied Biosystems, США), что позволило получить информацию о нуклеотидной последовательности участка генома размером около 1143 н.о. Нуклеотидные последовательности анализировали методом Clustal W с помощью программы Megaling (DNAStar V 5.00, Lasergen Inc., США).

Результаты и обсуждение

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 16 штаммов, выделенных у хронически инфицированных лиц в Республике Саха (Якутия), показал наличие трех генотипов ВГВ. Генотипы D и А обнаружены в семи случаях каждый (по 44%), генотип С - в двух изолятах (12%). Кроме того, в этой группе были идентифицированы субгенотипы каждого изолята. Из семи образцов, принадлежащих генотипу ВГВ D, в шести определен субгенотип D3 (86%) и в одном - D2 (14%). В случаях принадлежности ВГВ к генотипам А и С определены только субгенотипы А2 и С2 (рис. 1).

Анализ нуклеотидных последовательностей изученных изолятов по локализации замен и деле-ций в том или ином участке преS1/преS2/S-генов позволил выявить значительное количество замен. В таблице 1 приведены замены, выявленные в изо-лятах, принадлежащих к генотипу D.

Субгенотиповая принадлежность исследуемых изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической ГВ-вирусной инфекцией в Республике Саха (Якутия). Дендрограмма, построенная на основе сравнения нуклеотидных последовательностей преS1/преS2/S-генов (2874 - 835 н.о.) различных изолятов ВГВ

Рисунок 1. Субгенотиповая принадлежность исследуемых изолятов ВГВ, выделенных у пациентов с хронической ГВ-вирусной инфекцией в Республике Саха (Якутия). Дендрограмма, построенная на основе сравнения нуклеотидных последовательностей преS1/преS2/S-генов (2874 - 835 н.о.) различных изолятов ВГВ