Изучение показателей иммунитета при вакцинации против гепатита В

20.10.2008

Elispot. Elispot-анализ проводили с использованием набора IFN-у BD™ Elispot Set (BD Biosciences, San Diego, США) в соответствии с инструкцией производителя. При постановке реакции Elispot на первом этапе осуществляли сорбцию анти-ИФН-у-моноклональных антител с концентрацией 5 мкг/мл в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (pH 7,2) на лунку 96-луночного планшета BD™ Elispot. После инкубации в течение 12 часов при 4 °С каждую лунку дважды промывали блокирующим раствором (фосфатно-солевой буфер pH 7,2, содержащий 10%-ную фетальную бычью сыворотку) и инкубировали с этим раствором в течение 2-х часов при 25 °С.

В качестве клеток-эффекторов использовали мононуклеарные лимфоциты периферической крови в концентрации 5 х 105 клеток/мл. В качестве специфического антигена использовали природный HBsAg («Внутрилабораторный контроль HBsAg» ЗАО «Вектор-Бест», пос. Кольцово), в качестве неспецифического индуктора пролиферации - фитогемагглютинин (ФГА, Sigma, США) в концентрации 5 мкг/мл 100 мкл на лунку. Моно-нуклеарные лимфоциты в количестве 100 мкл на лунку вносили в подготовленный планшет и культивировали в присутствии 5% СО2 при 37 °С в течение 18 часов. ИФН-у-секретирующие клетки визуализировали, используя инкубацию в течение 2-х часов при 25 °С с биотинилированными анти-ИФН-у-антителами (2 мкг/мл) в 100 мкл блокирующего раствора, с последующей инкубацией в течение часа при 25 °С с 0,25 мкг/мл конъюгата Avidin-HRP в 100 мкл блокирующего раствора. Внесение каждого компонента проводили с последующей трех- и пятикратной отмывкой фосфатно-солевым буфером с 0,05% Tween-20. Окрашивание производили, используя субстрат для пероксидазы из набора BD™ AEC Substrate Reagent Set (BD Biosciences, Сан-Диего, США). Реакцию останавливали удалением реагентов и трехкратным промыванием лунок дистиллированной водой.

Регистрацию и обработку результатов реакции Elispot проводили на AxioCam, Stemi 2000C с помощью программы AxioVision Rel. 4.5 «Carl Zeiss» (Германия). Определяли отношение спотов (ИФН-у-продуцирующих клеток) в экспериментальной (стимулированной специфическим антигеном) лунке к количеству спотов в контрольной (нести-мулированной) лунке. Кратность превышения была обозначена как индекс специфической стимуляции мононуклеаров. Реакцию считали положительной, если наблюдался ответ на митоген, индекс специфической стимуляции был больше 2-х и регистрировалось более 20-ти спот-формирующих единиц на 106 мононуклеаров. Такое превышение расценивается многими исследователями как значимый ответ на специфическую стимуляцию [18, 22].

Статистическая обработка. Индекс специфической стимуляции мононуклеаров и частота встречаемости определенного показателя в группе обследованных лиц были представлены в процентах с усредненными отклонениями. Статистическую обработку результатов проводили по таблицам Генеса, различия считали достоверными при p < 0,05 [2].