Изменение спектра циркулирующих генотипов вируса как показатель элиминации индигенной кори в России

17.08.2009

Материалы и методы

Материалами для выделения вируса и вирусной РНК служили взвесь мононуклеарных клеток периферической крови, образцы мочи и носоглоточных смывов и соскобов, собранные в сроки и по протоколу, рекомендованному ВОЗ [7, 8]. Клинический диагноз подтверждали лабораторно путем выявления в сыворотке крови специфических коревых IgM в тест-системе ИФА Enzygnost Anti-Measles Virus/IgM (Dade Behring, Германия).

Изоляцию вируса кори проводили на перевиваемой культуре клеток Vero/hSLAM [16]. Клетки выращивали в среде DMEM с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой при температуре 37 оС.

Выделение РНК вируса проводили из лизатов инфицированных клеток и клинических образцов с использованием набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (QiaGen, Нидерланды).

ОТ-ПЦР. Специфическая кДНК была синтезирована в реакции обратной транскрипции с прай-мером MN5 и набором реагентов для обратной транскрипции Superscript III (Invitrogen, США) в соответствии с протоколом производителя [10]. Полученная кДНК затем была амплифицирована в реакции «гнездовой» ПЦР с двумя парами прайме-ров: MN5, MN6 и внутренними праймерами Nf1alt5 и Nr7alt1g в соответствии с ранее опубликованным протоколом [10, 19].

Детекцию продуктов амплификации проводили при горизонтальном электрофорезе в 1,5%-ном геле агарозы с добавлением 1 мкл бромистого эти-дия в буфере 1 х TAE.

Секвенирование продуктов ПЦР проводилось специалистами компании «Евроген» (Институт биоорганической химии РАН, Москва). Продукты амплификации очищали от реакционной смеси, используя набор Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США). Реакцию секвенирования проводили с использованием набора DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences, США) и пары праймеров, фланкирующих С-концевой фрагмент N-гена (Nf1alt5 и Nr7alt1g), в соответствии с протоколом производителя на автоматическом секвенаторе MegaBace500 (Amersham Biosciences, США).

Генотипирование штаммов вируса кори проводили по стандартизованной методике, основанной на анализе нуклеотидной последовательности СООН-концевого фрагмента N-гена длиной 450 нуклеотидов (нуклеотиды 1126 - 1575) - наиболее вариабельного участка вирусного генома [15]. Нуклеотидные последовательности исследованных образцов были выровнены и проанализированы с использованием программ SeqMan II (DNASTAR, Inc., США) и BioEdit, версия 7.0.9 (Ibis Biosciences, США). Полученные последовательности сравнивали с последовательностями эталонных штаммов генотипов вируса кори и штаммов соответствующих генотипов, представленных в GenBank. Филогенетическое древо построено по методу «ближайших соседей» (Кимура 2-параметр) с использованием программы MEGA, версия 3.1.

Статистическую достоверность кластеризации оценивали методом bootstrap-анализа (500 повторов). Наименование штаммов - в соответствии с номенклатурой ВОЗ [15]. Представители всех генотипов (генетических вариантов), анализируемых в работе, депонированы в GenBank (номера GQ260640 - GQ260668).