Результаты применения метода полимеразной цепной реакции

01.11.2010

В этой связи значимыми преимуществами для подтверждения ИКБ обладает один из наиболее широко используемых тестов молекулярной диагностики - полимеразная цепная реакция. Она позволяет не только осуществлять детекцию ДНК боррелий в острый период заболевания, но и идентифицировать возбудителей до геновидов [17], а также осуществлять диагностику микст-инфекций [36].

Несмотря на то что аналитическая чувствительность ПЦР достигает 10 копий в исследуемом образце [25], имеются существенные ограничения этого метода, связанные с недостаточным, иногда кратковременным, накоплением возбудителя или его ДНК в различных биологических жидкостях и тканях. Поэтому диагностическая чувствительность ПЦР значительно варьирует в зависимости от выбранного клинического материала. При исследовании образцов биопсии кожи, взятых в месте локализации эритемы, она достигает 80 - 88%, а при хроническом атрофическом акродерматите - 92 - 100% [16, 27], что согласуется с результатами изоляции боррелий [15]. Высокие положительные показатели были получены при исследовании ПЦР-методом синовиальной жидкости пациентов с Лайм-артритом [28, 31]. Диагностическая чувствительность ПЦР при исследовании спинномозговой жидкости варьирует в очень широких пределах: от 12 до 100%; в среднем она составляет 23% [15, 18]. При исследовании ликво-ра пациентов с нейроборрелиозом положительные результаты ПЦР были получены в 50% случаев, когда срок взятия образцов не превышал двух недель от начала заболевания, а в более поздние сроки этот показатель снижается до 13% [24].

Большой интерес в качестве биоматериала для ПЦР представляет кровь - она обеспечивает возможность быстрой диагностики, что особенно важно при безэритемной форме ИКБ, с выявлением диссемина-ции возбудителя и случаев повторных заражений.

С момента первого обнаружения ДНК боррелий методом ПЦР в крови пациентов с мигрирующей эритемой проведено большое количество подобных исследований [21]. Однако до настоящего времени нет единого мнения об эффективности использования цельной крови, плазмы или сыворотки для этой цели. Показатели выявления генетического материала боррелий в таких образцах чрезвычайно варьируют (от 4 до 100%) [15, 20, 25, 34], но, как правило, они невысоки [15, 19]. Средний показатель чувствительности метода по результатам шести исследований, проведенных в 2005 году в Европе и США, составил 14% [15]. Такой незначительный процент выявления ДНК нередко связывают с непродолжительной и неинтенсивной спирохетемией при гематогенной диссеминации возбудителя [38], что подтверждается показателями частоты изоляции боррелий из крови [10, 26, 32]. Однако после проведенной оптимизации культурального метода удалось обнаружить возбудитель в крови в значительно большем проценте случаев [40]. Это дает основание полагать, что эффективность ПЦР может быть также повышена при совершенствовании ее методики, например при правильном выборе ДНК-мишеней и соответствующих им праймеров [15]. Несмотря на использование огромного количества разнообразных мишеней, только несколько сохранили свою значимость в настоящее время. Среди них - область межгенного спейсера РНК rrf (5S) - rrl (23S) [30, 39]. Применение праймеров сразу к нескольким ДНК-мишеням в определенной степени повышает чувствительность реакции [16, 31], хотя иногда даже набор праймеров не всегда обеспечивает ее достаточную эффективность. Кроме того, наличие в крови ингибиторов этой реакции - существенный недостаток, который может снизить количество положительных результатов [14, 15, 35]. В то же время как в нашей стране, так и за рубежом пока не стандартизованы разные этапы проведения ПЦР (выделение ДНК из различных биологических жидкостей и тканей, режим амплификации и др.) [35]. Один из факторов, способных значительно повысить результативность этой реакции для диагностики ИКБ, - определение в динамике инфекционного процесса временного промежутка, оптимального для взятия крови и постановки ПЦР. Такой временной интервал пока не установлен, хотя нередко высокие положительные показатели, полученные в ПЦР, регистрировали в ранние сроки от начала заболевания [9, 22]. Этот вопрос ввиду своей значимости требует более детального изучения.

Цель работы - определение оптимальных сроков детекции ДНК боррелий в крови пациентов методом ПЦР при лабораторной диагностике ИКБ.