Результаты применения метода полимеразной цепной реакции

01.11.2010

Материалы и методы

В весенне-летний период 2007 года в Пермскую краевую клиническую инфекционную больницу (ККИБ) поступил 251 пациент с острыми лихорадочными заболеваниями (ОЛЗ), развившимися после присасывания клеща. Среди них было 128 женщин и 123 мужчины в возрасте от 15 до 84 лет. Большинство (78,9%) госпитализированы в первые семь дней от начала заболевания.

Серологическое обследование пациентов проводили методом ИФА на базе диагностической лаборатории ККИБ в динамике заболевания: при поступлении в стационар и через 10 - 14 дней. Для выявления иммуноглобулинов M и G к Borrelia burgdorferi sensu lato и к вирусу клещевого энцефалита (КЭ) использовали тест-системы производства ООО «Омникс» (Санкт-Петербург) и ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Серодиагностику грануло-цитарного анаплазмоза и моноцитарного эрлихиоза человека (ГАЧ и МЭЧ) проводили в тех случаях, когда имелись клинические и лабораторные данные, характерные для этих заболеваний [1, 3]. С этой целью использовали тест-системы ООО «Омникс» для выявления IgM и IgG к Ehrlichia chaffeensis и Anaplasma phagocytophilum. В дальнейшем серологическое обследование осуществляли раз в квартал в течение года при диспансеризации реконвалесцентов или при их обращении с жалобами на состояние здоровья.

На основании клинико-серологических данных у 127 (50,6%) пациентов диагностированы ИКБ в виде моно- и микст-инфекции. У 106 (83,5%) из них выявлена локализованная стадия заболевания с мигрирующей эритемой, у 21 (16,5%) - диссе-минированная стадия с развитием как эритемной, так и безэритемной форм и поражениями опорно-двигательного аппарата, печени, сердечно-сосудистой и нервной систем. Среди микст-инфекций диагностированы сочетания ИКБ с КЭ, ГАЧ и геморрагической лихорадкой с почечным синдромом.

Для обследования методом ПЦР в первые 50 - 60 дней от начала заболевания у всех пациентов трижды были взяты пробы цельной крови из локтевой вены (по 1 мл в пробирки Eppendorf, содержащие 0,1 мл антикоагулянта EDTA). От каждого больного получено как минимум по две пробы (первую брали при поступлении пациента в стационар - до начала антибиотикотерапии, вторую - через 10 - 14 дней после первой). У 132 пациентов была взята третья проба через 30 и более дней после второй (несколько проб были взяты раньше). В общей сложности получены 634 пробы крови (табл. 1), из них 346 проб -от 127 пациентов с диагнозом ИКБ, установленным клинико-серологическим методом (табл. 2).

ПЦР проводили в лаборатории переносчиков инфекций НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Для получения геномной ДНК из цельной крови использовали коммерческий набор «Проба-НК» (ЗАО «ДНК-Технология», Москва). ПЦР проводили в четырехканальном термоциклере «Тер-цик» этой же фирмы. При необходимости пробы хранили при температуре -20 °С.

Для амплификации в «nested» ПЦР использованы родоспецифичные праймеры Borrelia burgdorferi sensu lato (Bb23SN1 - Bb23SC1 и IGSb1 - IGSa2), фланкирующие участок 5S - 23S rРНК-спейсера [30].

С целью контроля и правильной интерпретации результатов использована ДНК Borrelia burgdorferi sensu stricto (типовой штамм B31). Амплифициро-ванная ДНК исследована методом горизонтального электрофореза в 1 - 2%-ном агарозном геле в присутствии бромистого этидия и трис-боратного буфера при напряжении 165 B; для анализа ага-розных гелей использована видеосистема DNA Analyzer с программами Gel-Imager и Gel-Аnalysis версии 1.0.