Сравнительное изучение адъювантных свойств различных форм хитозана

01.11.2010

Материалы и методы

Вирусы. В работе использовалась ЖХАГВ в виде штамма А(Н2М2)/Краснодар/101/35/59, полученного путем длительных пассажей в 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах при субоптимальной температуре [2].

В качестве инактивированной гриппозной вакцины применялась инактивированная расщепленная вакцина Ваксигрипп (Sanofi Pasteur, Франция).

Как антиген при проведении ИФА с вакциной Ваксигрипп использовали производственный штамм вируса гриппа человека А(Н1М1)/1УР-116.

Хизотан. В качестве адъювантов для гриппозных вакцин были взяты глютамат хитозана (М.В. 300 кДа), деацетилированного на 85% (в конечной концентрации - 0,5%) в 0,2 М глютаматном буфере (рН 6,2) [3], а также микрочастицы сульфата хитозана диаметром 1000 - 3000 нМ. Микрочастицы были получены путем добавления к раствору хитозана сульфата натрия (25 мМ) - фактора, способствующего разделению фаз. В экспериментах применяли 0,5% суспензию микрочастиц хитозана в 0,2 М фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0,14 М NaCl.

В работе использовали беспородных мышей весом 10 - 12 г. При интраназальной иммунизации мышей ЖХАГВ к различным дозам (1010 - 1050 ЭИД5^0,05 мл) добавляли 1% раствор глютамата хитозана (рН 6,2), чтобы получить 0,5% концентрацию соли хитозония с глютаминовой кислотой. Мышей под легкой эфирной анестезией интраназально иммунизировали двукратно различными дозами ЖХАГВ с хитозаном и без него, вводя по 25 мкл в каждую ноздрю. Вторую иммунизацию проводили на 21-й день после первой. Через 10 дней после второй иммунизации у мышей брали кровь и затем препарировали, извлекая различные отделы респираторного тракта и легкие. При иммунизации инактивированной гриппозной вакциной Ваксигрипп мышам вводили под эфирным наркозом 0,05 мл вакцины, содержащей 0,75 мкг вирусного белка каждого се-ротипа и 0,5% глютамата хитозана или 0,5% суспензии микрочастиц сульфата хитозана в конечной концентрации. В контрольных экспериментах препараты хитоза-на заменяли физиологическим раствором.

Эвтаназию мышей проводили согласно Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных.

ИФА для определения вирус-специфических IgG и IgA проводили по описанной методике [17] в 96-лу-ночных планшетах (Corning Incorporated 3591), которые предварительно сенсибилизировали 400 ГАЕ/0,1 мл концентрированного и очищенного вируса A(H1N1)/IVR-116 или концентрированного и очищенного A(H1N1)/Краснодар/101/35/59. За конечное разведение принимали наивысшее значение оптической плоскости образца при 490 нм, превышающее средний показатель в контрольных образцах более чем на три стандартных отклонения. Достоверность различий устанавливали с помощью двувыборочного t-теста Стьюдента при Р < 0,05.

Результаты и обсуждение

На первом этапе нашей работы было проведено сравнительное изучение адъювантных свойств раствора глютамата хитозана и суспензии микрочастиц сульфата хитозана при интраназальной иммунизации мышей штаммом-донором аттенуации A(Н2N2)/ Краснодар/101/35/59. С этой целью десятикратные разведения вируссодержащей жидкости штамма-донора аттенуации, содержащие в конечной концентрации 0,5% раствор глютамата хитозана или 0,5% суспензию микрочастиц сульфата хитозана, вводили двукратно интраназально лабораторным животным и сравнивали титр сывороточных антител, ингибирую-щих гемагглютинацию в РТГА. Как видно из таблицы 1, введение различных форм хитозана в состав живой гриппозной вакцины приводило к существенному повышению титра сывороточных антител, ин-гибирующих гемагглютинацию. При интраназальной иммунизации ЖХАГВ в сочетании с 0,5% суспензией микрочастиц сульфата хитозана титры сывороточных антител, ингибирующих гемагглютинацию, были несколько выше (см. табл. 1). Следует отметить, что существенное повышение титра сывороточных антител наблюдалось при интраназальном введении незначительных количеств живого вакцинного вируса.