Распространенность первичной лекарственной резистентности вируса гепатита В

03.02.2011
Интенсивность циркуляции ВГВ регионы рФ Количество пациентов с ГВ
Высокая Республика Саха (Якутия) 58
Республика Тыва 137
Средняя Саратовская область 49
Низкая Московская область 100
Тамбовская область 115

Таблица 1. Распределение пациентов по регионам РФ, отличающимся разным уровнем интенсивности циркуляции вируса гепатита В

Участок генома ВГВ Последовательности Положение Направление
S/Р-ген 5'-cct get ggt ggc tcc agt tc-3' Внешнее Прямое
S/Р-ген 5'-cca caa ttc ktt gac ata ctt tcca-3' (k = g/t) Внешнее Обратное
S/Р-ген 5'-gca cac gga att ccc gag gac tgg gga ccc tg-3' Внутреннее Прямое
S/Р-ген 5'-gac acc aag ctt ggt tag ggt tta aat gta tacc-3' Внутреннее Обратное

Таблица 2. Детекция участка генома вируса ГВ и амплификации домена обратной транскриптазы его полимеразы

Во всех образцах сывороток крови, полученных от пациентов с ВГВ-инфекцией и лиц из группы условно здорового населения, положительных по анти-НВс и HBsAg, определяли ДНК ВГВ в полиме-разной цепной реакции (ПЦР). Выделение нуклеиновых кислот из образцов сывороток крови проводили методом экстракции фенолхлороформом с помощью набора для выделения ДНК/РНК из сыворотки или плазмы крови (ООО «НПФ «ЛИТЕХ»). Определение ДНК ВГВ проводили в ПЦР с прайме-рами к консервативному участку перекрывающихся генов S и Р, кодирующих поверхностный белок и ДНК-полимеразу ВГВ (табл. 2).

Для образцов, положительных по ДНК ВГВ в ПЦР, определяли последовательность домена обратной транскриптазы ДНК-полимеразы ВГВ с целью выявления возможных мутаций в этом участке, связанных с развитием лекарственной устойчивости ВГВ. Секвенирование данного участка генома позволяет также достоверно определять генотип ВГВ. Продукт амплификации величиной 713 нт вырезали из геля и выделяли из агарозы с помощью набора QIAquick Gel Extraction kit (QIAGEN). Секвенирование проводили с использованием набора GenomeLab Methods Development kit (Beckman Coulter Inc.) в анализаторе СEQ 8800 (Beckman Coulter Inc.). Полученные последовательности сравнивали с референсными, депонированными в GenBank, соответствующими «дикому» типу ВГВ и мутантным вариантам с подтвержденной лекарственной устойчивостью к пяти нуклеоз(т)ид-ным аналогам, применяемым в настоящее время для терапии ВГВ-инфекции: ламивудину, адефовиру, энтекавиру, тенофовиру, телбивудину. Филогенетический анализ последовательностей ВГВ проводили с помощью программы Mega 4.0.