Результаты дополнительного изучения свойств вакцинного штамма ЭШЧ вируса кори

06.08.2011

Л.Л. Миронова1, В.Д. Попова1, О.И. Конюшко1, С.В. Шульга2, Н.Т. Тихонова2

1 ГУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН, Москва

2ФГУН «МНИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, Москва

Введение

Глобальная программа борьбы с корью, разработанная ВОЗ, поддержана нашей страной и нашла отражение в Программе ликвидации кори в России к 2010 году, утвержденной МЗ РФ в 2002 году [1]. В связи с этим усилия по созданию новых профилактических препаратов и средств диагностики данного заболевания продолжают сохранять свою актуальность.

Сделаем небольшой экскурс в историю создания ЖКВ под руководством М.П. Чумакова. Начало работе было положено в 1965 году. В течение 1965 - 1969 годов было осуществлено крупномасштабное производство ЖКВ на первичных культурах клеток почек зеленых мартышек и почек эмбрионов и новорожденных овец [4, 9].

В 1989 - 1992 годах в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова были получены серии ЖКВ при репродукции вакцинного штамма ЭШЧ вируса кори в линии лицензированных диплоидных клеток эмбриона человека М-22. Наличие банка посевных и рабочих клеток линии М-22 не привело к успеху в деле создания ЖКВ, хотя этому были все предпосылки. Причина заключалась в том, что штамм ЭШЧ изменил свои биологические свойства и перестал размножаться в клетках линии М-22. Тогда из криобанка были выбраны две линии перевиваемых клеток зеленых мартышек - 2688С и 4647 - и получены утешительные результаты в смысле репродукции на них штамма ЭШЧ [5, 6]. Казалось, путь к получению ЖКВ открыт, но опять проблема: линия 2688С нуждается в лицензировании, что могло потребовать много времени и средств; единственным кандидатом в вакцинные субстраты остается лицензированная гетероплоидная линия 4647, сложность использования которой состоит в необходимости контроля готового продукта на присутствие клеточной ДНК с последующим ее удалением. Правда, на современном уровне развития биотехнологии эта проблема вполне разрешима. Следует отметить, что по своим свойствам указанные линии клеток обезьян могут быть использованы для изучения вакцинных штаммов вируса кори и диагностики коревой инфекции.

Цель многолетней работы сотрудников ИПВЭ им. М.П. Чумакова - создание живой коревой вакцины (ЖКВ) на линиях перевиваемых клеток, которые являются более перспективным субстратом для размножения вакцинного штамма вируса кори, чем первичные культуры клеток эмбрионов японских перепелов, используемые в настоящее время для производства вакцины.

Материалы и методы

Выделение РНК вируса проводили из лизатов инфицированных клеток с использованием набора для выделения РНК QIAamp Viral RNA Mini Kit (QiaGen, Нидерланды).

Обратнотранскриптазная ПЦР (ОТ-ПЦР)

При работе с праймерами MV60 (GCT ATG CCA TGG GAG TAG GAG TGG, нт 1108 - 1131) и MV63 (CTG GCC CTC GGC CTC TCG CAC, нт 1686 - 1706), фланкирующими используемый для генотипиро-вания вируса кори участок (разработаны и предоставлены Measles Virus Section, CDC, Атланта, США), реакция ОТ-ЦР проводилась по однопробирочно-му варианту с использованием набора Superscript One-Step RT-RCR (Invitrogen, США). Реакцию осуществляли в амплификаторе Mastercycler personal (Eppendorf, Германия), применяя следующую программу: 55 °С - 30 мин, 94 °С - 2 мин (94 °С - 15 с, 55 °С - 30 с, 72 °С - 30 с) - 40 циклов, 72 °С -7 мин.

Детекция продуктов амплификации

Проводилась при горизонтальном электрофорезе в 1,5%-ном геле агарозы с добавлением 1 мкл бромистого этидия в 1 х ТАЕ-буфере.

Секвенирование

Продукты амплификации очищали из реакционной смеси, используя наборы Wizard® SV Gel and RCR Clean-Up System (Rromega, США). Реакцию секвенирования проводили с помощью набора DYEnamic ЕТ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham Biosciences, США) - в соответствии с протоколом фирмы-производителя на автоматическом секвенаторе MegaBace500 (Amersham Biosciences, США) - и пары прайме-ров, фланкирующих С-концевой фрагмент N-гена (MV60 и MV63).

Генотипирование, филогенетический анализ

Нуклеотидные последовательности С-концевого фрагмента N-гена вируса кори длиной 450 нуклео-тидов (нуклеотиды 1126 - 1575) исследованных образцов сравнивали с последовательностями эталонных штаммов генотипов вируса кори, представленных в GenBank. Нуклеотидные последовательности анализировали с использованием программ SeqMan, BioEdit Sequence, Clustal W и TreeView.

Применены авторские линии перевиваемых клеток: линии диплоидных клеток эмбриона человека М-22, линии клеток зеленых мартышек - семенников новорожденной обезьяны 2688С, почек взрослой зеленой мартышки 4647, производные от нее - РАМТ, 4647 ТК, внутрилинейный гибрид (РАМТ Х4647 ТК), селезенки взрослой зеленой мартышки 455, линии клеток сердца и языка, почек эмбрионов зеленых мартышек - 4179 и 5500.

Культуры клеток инокулировали штаммом ЭШЧ вируса кори, полученным при его размножении на линии клеток М-22. Вирус хранился в ампулах в лиофилизированном состоянии при 12 - 20 °С с 1990 года. Ампулы объединены в 11 групп (серий) и обозначены 1064, 1146, 1236, 1237, 1238, 1238а, 1494, 1496, 1555, 1562, 1565.

Заражение клеток проводили по общепринятой методике. Титр вируса определяли методом образования негативных колоний при внесении испытуемого материала в клетки линий 2688С и 4647. Показатели титров выражали в lg БОЕ/мл.