Результаты дополнительного изучения свойств вакцинного штамма ЭШЧ вируса кори

06.08.2011

Результаты и обсуждение

Ранее были опубликованы результаты авторских исследований по размножению вакцинного штамма ЭШЧ вируса кори в линиях перевиваемых клеток человека и животных [2, 3, 10]. В настоящее время появились дополнительные сведения, имеющие, на наш взгляд, важное значение.

В последнее время мы были озабочены вопросом, сохраняет ли стабильными свои свойства вакцинный штамм ЭШЧ, но он удачно разрешился после проведения дополнительных исследований специалистами из ФГУН «МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского» в Национальном научно-методическом центре по надзору за корью, являющемся Региональной референс-лабораторией ВОЗ по надзору за корью/краснухой для стран СНГ.

Объектом изучения были две пробы вируса кори, штамм ЭШЧ, зарегистрированные под номерами 5660 и 5995. Первая проба получена при размножении вируса в клетках линии 2688С, вторая - в клетках линии 4647.

Обе культуры были заражены одним материалом, представляющим собой лиофилизированную ЖКВ, изготовленную на клетках линии М-22 (ампула № 1238).

Проба 5660 получена после трех перевивок на линии 2688С (41-го, 42-го, 44-го пассажей). Значения титров в той же последовательности были: 4,82; 4,00; 4,68 lg БОЕ/мл.

Проба 5995 представляет вирус 2-го пассажа на линии 4647 с титром 5,5 lg БОЕ/мл. В первом пассаже титр был 5,17. Клетки линии 4647 заражали на уровне 93-го и 95-го пассажей.

Прежде всего этими пробами инокулировали культуры клеток Vero/hSLAM, на которых через 24 - 28 часов наблюдался выраженный цитопати-ческий эффект в виде формирования множественных многоядерных симпластов [11]. Этот эффект не отличался от такового, вызванного контрольными образцами (вакцинный штамм вируса кори Эдмонстон и изолят дикого штамма генотипа Д6 MVi/Moscow. RUS/05.04/2).

Из исследованных образцов была выделена вирусная РНК и проведена диагностическая ОТ-ПЦР с праймерами, фланкирующими СООН-концевой участок N-гена вируса кори. Тест для исследованных образцов был положительным.

Продукты амплификации, полученные в ходе ПЦР, были использованы для секвенирования.

Генотипирование проводили по результатам секвенирования СООН-концевого фрагмента N-гена вируса кори длиной 450 нуклеотидов, в соответствии с рекомендациями ВОЗ [12].

Последовательности нуклеотидов СООН-концевого фрагмента N-гена были идентичными для исследованных образцов и отличались от аналогичной последовательности вакцинного штамма вируса кори Эдмонстон наличием мутации Т1435А, приведшей к аминокислотной замене в структуре белка S480I Таким образом, исследованные образцы - это представители генотипа А, к которому относятся все известные вакцинные штаммы вируса кори. Следовательно, штамм вируса кори ЭШЧ является вакцинным.

На рисунке 1 представлено филогенетическое древо штаммов ЭШЧ вируса кори.

В таблице 1 приведены результаты размножения штамма ЭШЧ в линиях 2688С и 4647 при первичном заражении и максимальные величины титров, полученные в процессе 3 - 6-го пассажей в этих же культурах. Для сравнения даны титры вируса после лиофилизации.

Следует отметить важный факт: все 45 заражений оказались успешными, это значит - вакцинный вирус сохранился в жизнеспособном состоянии. В клетках линии 2688С в 65% случаев титр был выше значений титра лиофилизированного вируса, в клетках линии 4647 аналогичный показатель достиг 94%. Соответственно на первой культуре максимальный титр был 6,09, на второй -6,37 lg БОЕ/мл. Такой скрупулезный учет показателей титров вакцинного штамма вируса кори ЭШЧ требуется для правильного выбора производственного штамма посевного вируса с оценкой его пригодности к выпуску вакцин.

Дополнительно к ранее опубликованным материалам представлены результаты репродукции штамма ЭШЧ в клетках линии РАМТ, которая является дериватом линии 4647, установленным путем культивирования клеток на селективной среде «Игла» с 8-азагуанином, 6-меркаптопурином, 6-тиогуанином. Эта линия дефектна по гену фермента гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфе-разы (ГФРТ) [7]. При первичном заражении материалом четырех ампул разных групп получены высокие результаты. Титры колебались от 4,69 до 5,15 lg БОЕ/мл. Симпласты в культурах развились на 5-е сутки, а на 6-е сутки большая часть клеток отслоилась, вакуолизация цитоплазмы обнаружена в двух из четырех образцов материала ампул, в которых были отмечены наивысшие показатели титров. Взвесь на титрование взята на 6-е сутки. Подсчет количества бляшек проводили с 6-х по 12-е сутки.