Совершенствование иммунодиагностики хеликобактериоза

06.08.2011

И.О. Вартанова1, В.Г. Арзуманян1, А.В. Поддубиков1, И.П. Ванеева1, О.А. Сердюк2

1 ГУ «НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова» РАМИ, Москва

2 Институт диагностики и профилактики социально значимых заболеваний, Москва

В мировой практике при проведении эпидемиологических исследований хеликобактериоза чаще всего применяют иммуноди-агностические методы. Первое поколение антигенных препаратов из Н. pylori, используемых и в настоящее время, включает: целые бактериальные клетки; кислотно-глициновые экстракты биомассы; клетки, обработанные формалином; ультразвуковые экстракты клеток [10]. Известно более 20-ти антигенных белков Н. pylori, наиболее специфическими из которых являются: Vac A - вакуолизирующий цитотоксин (мол. масса 87 - кДа); Cag A - цитотоксин-ассоцииро-ванный белок (140 кДа); субъединицы уреазы -Ure A (29,5 кДа) и Ure B (66 кДа); жгутиковые флагеллины - FlaA и FlaB (55 - 61 кДа); мембранный белок (аналог флаводоксина) - Fld A (19 кДа); адгезин - HpaA (30 кДа) и нейтрофил-активирующий белок - NapA (26 кДа) [6, 9, 13]. В новом поколении антигенных препаратов используют комплекс высокоочищенных белков, процесс получения которых весьма трудоемок и требует немалых экономических затрат. Учитывая, что некоторые высокоспецифичные антигены H. pylori обнаруживаются во внеклеточном пространстве - например, HpaA, NapA (26 кДа), FlaA и FlaB, - можно получать антигенные ком-лексы Н. pylori, используя только культуральную жидкость (КЖ) [9]. Такой подход, причем без специальной очистки КЖ, возможен при наличии разработанной ранее синтетической среды определенного химического состава [1].

Цель настоящего исследования - разработка метода получения высокоспецифичного внеклеточного антигенного препарата из Н. pylori при использовании синтетической среды.

Материалы и методы

Сыворотки крови получены от больных язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, проходивших лечение в стационаре ЦНИИ гастроэнтерологии, и от здоровых доноров - на Московской станции переливания крови.

Антигенные препараты получали используя штамм № 2 Н. pylori из коллекции ГУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН.

Определение специфических IgG-антител в сыворотках крови проводили с помощью твердофазного варианта иммуноферментной реакции (ИФА) [2]. В качестве конъюгата использовали иммуноглобулины кролика против иммуноглобулинов G человека, меченных пероксидазой. Результаты реакции учитывали, измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 492 нм на приборе Multiskan и выражали в условных единицах в 1 мл сыворотки. Результаты рассчитывали по формуле:

X = (ОПан - ОПф) х 40 / ОПк-, где

ОПан - оптическая плотность анализируемой сыворотки;

ОПф - оптическая плотность фона; ОПк - оптическая плотность «отрицательного контроля»;

40 - условный коэффициент, соответствующий содержанию антител в пуловой сыворотке.

Реакцию считали положительной, если значения Х были выше среднего арифметического в группе здоровых доноров.

Иммуноблоттинг антигенных препаратов с сыворотками проводили в соответствии с принятыми методами [3, 4, 7, 12]. Для электрофореза белков в градиенте 5 - 20% полиакриламидно-го геля пользовались методом У.К. Лэммли [8]. Образец готовили в невосстанавливающих условиях (без меркаптоэтанола и без нагревания). После электрофореза перенос белков на нитроцеллюлозу осуществляли в аппарате для полусухого переноса Novablot (фирма Amersham-Pharmacia, Швеция) в соответствии с инструкцией к прибору. В качестве конъюгата использовали иммуноглобулины кролика против человеческих IgG, меченных перокси-дазой (производство Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, РАМН), а в качестве красителя - 4-хлор-1-нафтол.

В исследовании использовали три антигенных препарата - два клеточных и один внеклеточный. Для получения первого клеточного препарата клетки H. pylori культивировали в течение 4-х суток на плотной среде Columbia («ICN»), содержащей 5% крови. Клетки собирали, промывали физиологическим раствором, центрифугировали 20 минут при 3000 об./мин и осадок суспендировали в 1 мл дистиллированной воды. Суспензию озвучивали 40 минут с частотой 50 Гц при температуре 10 - 15 °C, после чего вновь центрифугировали 20 минут с той же угловой скоростью. Супернатант фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,2 мкм и лиофилизи-ровали (препарат I). Аналогично обрабатывали осадок клеток H. pylori, выращенных во флаконах с синтетической средой [1] (препарат II). Внеклеточный антигенный препарат получали путем лиофильного высушивания бесклеточной культуральной жидкости, полученной после выращивания H. pylori в той же синтетической среде (препарат III).

Полученные антигенные препараты исследовали методом иммуноблоттинга с сыворотками крови больных язвенной болезнью. Из имеющихся в наличии были выбраны 17 сывороток крови больных, у которых культуральным методом обнаруживали H. pylori.