Роль дефенсинов как факторов врожденного иммунитета

03.11.2011

Известно, что миндалины, являясь частью иммунной системы человека, играют важную роль в процессах ее развития и функционирования. Многие патологические состояния, связанные с поражением миндалин, в том числе ангина, хрониче- ский тонзиллит, паратонзиллит и некоторые другие, весьма распространены, однако их патогенез изучен недостаточно. В частности, остается неясной роль противомикробных пептидов, в том числе дефенсинов, в гомеостазе миндалин. К классу «естественных антибиотиков» можно отнести β-дефенсины 1-3 человека, которые вырабатываются в основном эпителиальными клетками слизистых оболочек и обладают прямым противовирусным, антибактериальным и противогрибковым действием [4, 5]. Wang С. с соавт определили уровень экспрессии HBD-1 и HBD-2 в небных миндалинах здоровых людей (в норме) и у пациентов с хроническими тонзиллитами. В результате было сделано заключение о существенной роли данных факторов врожденного иммунитета в функционировании миндалин. Показано, что HBD-1 человека экспрессируется на уровне мРНК практически во всех взятых образцах ткани миндалин как в норме, так и при патологии. HBD-2 экспрессируется только у больных хроническим тонзиллитом и практически не определяется в норме у здоровых людей [6].

Цель работы - определение уровней экспрессии генов а- и β-дефенсинов у детей с тяжелой формой острых и рецидивирующих паратонзиллитов.

Материалы и методы

На базе Морозовской детской больницы проводился анализ результатов обследования больных паратонзиллитами, находившихся в стационаре клиники в связи с тяжелым течением заболевания с 2007 по 2010 год. Под медицинским наблюдением находилось 140 пациентов в возрасте от 2-х до 17 лет с диагнозом «острый паратонзиллит». Клинические методы исследования включали: изучение соматического статуса пациента и оценку жалоб, предъявляемых детьми и их родителями при поступлении в стационар. При осмотре ЛОР-органов оценивали выраженность фарингоскопических признаков паратонзиллита (асимметрия зева за счет смещения небной миндалины к центру на стороне поражения, отек и гиперемия передней небной дужки), состояние регионарных лимфатических узлов и тризм жевательной мускулатуры.

Определение концентрации HNP-1 - 3 в сыворотке крови проводилось с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), с использованием тест-системы фирмы HyCult Biotehnology (Нидерланды).

Уровень экспрессии гена HBD-2 в эпителиальных клетках слизистой оболочки небных миндалин определялся методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для этого из клеток слизистой небных миндалин при помощи комплекта реагентов «РИБО-сорб», предназначенного для выделения РНК/ДНК из клинического материала, в строгом соответствии с протоколом выделяли РНК.

На следующем этапе исследований проводили реакцию обратной транскрипции. В эппендорфах (Axygen, США), погруженных в холодный штатив, готовили смесь праймеров: 3 мкл обратного прай-мера (HBD-2, 1 ОЕ/мкл, «Синтол», Россия), 1 мкл random-праймера (шестичленные олигонуклеоти-ды со случайной последовательностью, 5 ОЕ/мкл, «Синтол», Россия) на одну пробу. Смесь вносили по пробиркам по 4 мкл на эппендорф. Добавляли по 4 мкл пробы РНК, а в пробирку с отрицательным контролем - 4 мкл воды. Пробирки с пробами и праймерами инкубировали в твердотельном термостате при температуре 75 °С (термостат «Термит», «ДНК-Технология», Россия) в течение трех минут, затем добавляли 21 мкл реакционной смеси № 2 (10х буфер для ревертазы («Сибэнзим», Россия), dNTP 2,5 мМ («Синтол», Россия), M-mulv reverse transcriptase 0,1 мкл («Сибэнзим», Россия)). Затем пробирки помещали в амплификатор («Терцик», «ДНК-Технология», Россия) на один час при 37 °С, после чего проводили инактивацию фермента при 94 °С. Полученную в ходе реакции кДНК хранили при температуре минус 70 °С.