Роль дефенсинов как факторов врожденного иммунитета

03.11.2011

В работе применялся метод ПЦР-РВ. Последовательность праймеров HBD-2 подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0, анализируя последовательность генов, полученную из электронной базы данных GenBank. Реакционную смесь готовили из реактивов «Набора для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» («Синтол», Россия) согласно рекомендациям фирмы-производителя. После приготовления реакционных смесей пробирки помещали в амплификатор для ПЦР-РВ АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия), позволяющий анализировать образцы ДНК/РНК в динамическом диапазоне от 1 до 109 копий и одновременно детектировать четыре флуоресцентных красителя (FAM/SYBR Green, R0X, R6G, CY5) с заданной программой с числом циклов 35 - 40.

Изучение экспрессии исследуемого гена проводили относительно экспрессии гена актина. Для определения экспрессии гена β-актина помимо имеющейся системы использовали «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК β-актина человека» («Синтол», РФ). Все действия по постановке реакции осуществлялись согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов, рассчитывая в группах данных: среднее арифметическое - X (X = ∑ хi/n), дисперсию - ơ2 2 =∑(хi - X)2/n), среднее квадратичное отклонение - ơ (а = й2(х,- Х)2/п), гдех,- значение варианта, п - число экспериментов.

Применяли также компьютерные статистические программы BioStat и Excel. В работе результаты представлены в виде X ± а//todo. Для сравнения групп данных использовали непараметрические методы статистической обработки данных. В связи с разным числом наблюдений в каждой из групп для оценки статистической достоверности различий экспрессии генов в исследуемых группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [7].

Изменение уровней продукции HNP -1-3 в сыворотке периферической крови (А) и экспрессии гена HBD-2

* Показатель статистически значимо отличается от такового в норме (Р ≤0,05).

Рисунок 1. Изменение уровней продукции HNP -1-3 в сыворотке периферической крови (А) и экспрессии гена HBD-2 в эпителиальных клетках слизистой оболочки небных миндалин (Б) у детей с острым паратонзиллитом (по оси абсцисс - исследуемые группы, по оси ординат - концентрация HNP-1-3, нг/мл (А), lg количества копий к ДНК гена HBD-2 относительно 106 копий гена β-актина (Б))

Результаты и обсуждение

В сыворотке крови здоровых детей определяли концентрацию α-дефенсинов 1-3, которая составила 52, 6 ± 3,8 нг/мл, что соответствовало норме (от О до 150 нг/мл у здорового человека). Анализ концентрации противомикробных пептидов выявил у всех пациентов с острым паратонзиллитом резкое увеличение концентрации HNP-1 - 3 (в семь-восемь раз) - 808,5 ± 69 нг/мл (рис. 1А).

Выброс а-дефенсинов нейтрофилами в кровь является одним из регуляторных механизмов стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета за счет угнетения избыточной продукции глюко-кортикоидов, вызывающих подавление иммунных реакций. Перспективным является параллельный анализ экспрессии противомикробных пептидов на уровне генов и синтеза белка в клетках периферической крови в связи с поиском критериев прогноза течения паратонзиллитов.