Вакцина против вируса клещевого энцефалита на основе европейского прототипного штамма

03.11.2011

В настоящее время нами разработана модель для исследования антител, позволяющая анализировать нейтрализацию вирусов в условиях, когда сбалансированы их репликативная и инфекционная активность и одновременно сохранены индивидуальные особенности поверхностных антигенов различных штаммов ВКЭ, которые и определяют возможность их нейтрализации. Были сконструированы гибридные вирусы, содержащие кон-сенсусную последовательность капсида вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) и кодирующие поверхностные белки ргМ и Е различных штаммов ВКЭ. Такие гибриды ВЛЗН/ВКЭ использовались для оценки нейтрализующей активности образцов сывороток, полученных в ходе клинического испытания вакцины на основе штамма Neudoerfl. Соответствующие последовательности поверхностных белков для создания этих гибридов были выделены из прототипных штаммов разных подтипов ВКЭ и более отдаленной последовательности ргМЕ из ВОГЛ.

Цель данного исследования - количественная оценка уровня нейтрализующих антител против прототипных штаммов ВКЭ всех подтипов и близкородственного ВОГЛ у людей, привитых против КЭ.

Материалы и методы

Вирусы и клеточные линии

  1. Прототипный штамм Neudoerfl европейского подтипа ВКЭ, применяемый для производства вакцины ФСМЕ-Иммун (FSME-lmmun, Baxter), и штамм NY99-флaмингo 382-99 ВЛЗН «дикого» типа, полученный из Центра по контролю и профилактике заболеваний США (CDC), выращивание в соответствии с правилами надлежащей производственной практики.
  2. Клеточные линии А549 (Американская коллекция клеточных культур [АТСС] CCL-185), С6/36 (Европейская коллекция клеточных культур [ЕСАСС] 89051705) и Vero (АТСС CCL-81) получали из АТСС и ЕСАСС и культивировали, как описано ранее [13].

Процедуры клонированияи конструирование гибридных вирусов

Последовательности структурных белков ргМ и Е штаммов Neudoerfl (GenBank TEU27495) и К23 (GenBank АМ600965) европейского подтипа ВКЭ, штаммов Sofjin-HO (GenBank АВ062064) и Oshima 5-10 (GenBank АВ062063) дальневосточного подтипа ВКЭ, штамма Vasilchenko (GenBank AF069066) сибирского подтипа ВКЭ и ВОГЛ (GenBank NC_005062.1), фланкированные кодирующими областями ВЛЗН NY99 (GenBank AF196835), соответствующими нуклеотидам 269 - 411 на 5'-конце и нуклеотидам 2470 - 2563 на З'-конце, получали путем химического синтеза (GE-NEART), а затем клонировали в систему комплементарной ДНК (кДНК) ВЛЗН [13].

Для построения индивидуальных гибридных кДНК Munl- и BshTI-рестриктированные фрагменты синтезированных кодирующих кассет ргМ и Е ВКЭ лигировали с Munl- и BshTI-рестриктированной основой плазмиды pWNVsyn-5TL [13].

Для лигирования использовали ДНК-лигазу Т4 (New England Biolabs).

Плазмиды размножали в бактериальном штамме НВ101 (Promega) и очищали с применением наборов Qiagen. Для электропорации использовали установку Escherichia coli Pulser (ВТХ Harvard Apparatus; настройки: 1,8 кВ, 25 мкФ, 150 Ʊ), для секвенирования применяли прибор Genetic Analyzer 3130x1 (ABI) и набор для циклического секвенирования BIgDye Terminator (версия 3.1; ABI).

Для получения полноразмерной кДНК матриц гибридных вирусов плазмиду pWNVsyn-3TL [13] линеаризовали путем последовательного переваривания рестриктазой Xbal и нуклеазой золотистой фасоли.