Вакцина против вируса клещевого энцефалита на основе европейского прототипного штамма

03.11.2011

Индивидуальные 5'-фланкирующие частичные плазмиды, кодирующие поверхностные белки ВКЭ, и переваренную рестриктазой Xbal основу плазмиды pWNVsyn-3TL обрабатывали рестриктазой SphI и лигировали ДНК-лигазой Т4 (New England Biolabs). Продукты лигирования дважды экстра- гировали фенол-хлороформом, осаждали этанолом и ресуспендировали в безнуклеазной воде (Ambion).

Методы транскрипции РНК in vitro, трансфекции клеток Vero и иммуноблоттинга были описаны ранее [13].

Титрование вирусов и кривые роста

Клетки Vero, А549 и С6/36, выращенные во флаконах площадью 175 см2, инфицировали ВЛЗН дикого типа, штаммом ВКЭ Neudoerfl или гибридами ВКЭ с множественностью заражения (МЗ) 0,0001. После инкубации в течение одного часа вирусный инокулят удаляли, клетки промывали 10 мл среды DMEM и добавляли 75 мл свежей среды. Через 1, 6, 24, 48, 54, 72 и 96 часов после заражения из культуры отбирали по 1 мл среды. Титр вируса определяли с помощью методики оценки медианы инфекционной дозы для культуры ткани (TCID50), как описано ранее [13].

Синтез кДНК и количественная полимеразная цепная реакция

Вирусные РНК выделяли путем экстракции в реагенте TRIzol, осаждали этанолом и ресуспендировали в безнуклеазной воде. Для синтеза кДНК брали 1 мкл РНК; использовали набор Superscript III (Invitrogen) и праймеры, связывающиеся с З'-участ-ком неструктурного белка генома ВЛЗН. Для проведения количественной полимеразной цепной реакции (КПЦР) РНК гибридных ВКЭ экстрагировали через 24, 48, 54 и 72 часа после заражения с помощью набора QIAamp (Qiagen) в соответствии с инструкцией изготовителя. Для синтеза кДНК использовали набор iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad). КПЦР проводили с праймерами qPCR-WNV-FWD (3'-CAGAGCnGACAnGACTCCAT-5') и qPCR-WNV-RWD {5'-CAGAAATCACGAAAGCAGCAAA-3') и зондом qPCR-WNV (6FAM-CAnC-CAATGACTATCGCG); они связывались с одинаковой для всех гибридов последовательностью капсида ВЛЗН. КПЦР проводили в общем объеме 20 мкл, содержащем полиме-разный реагент TaqMan Gene Expression MasterMix (ABI), набор из двух праймеров, меченый зонд и кДНК, с использованием системы для ПЦР в реальном времени StepOnePlus (ABI). Для построения калибровочной кривой с целью определения геномных эквивалентов транскрибированную in vitro РНК генома репликона ВЛЗН (диапазон разведений от 1x102 до 1x109 копий РНК) обрабатывали так же, как образец.

Микрометод оценки реакции нейтрализации

В качестве контрольных препаратов использовали партии нормального иммуноглобулина для внутривенного введения (НИГ), произведенные по одной и той же технологии из донорской плазмы, собранной в США или Европе (KIOVIG или Gammagard liquid, Baxter). Препараты НИГ и образцы сывороток, полученных в клиническом испыта- нии, предварительно разводили средой DMEM в соотношении 1:10 или 1:20 и затем последовательно разводили той же средой с шагом «два». ВЛЗН, штамм Neudoerfl ВКЭ или гибриды ВКЭ в дозе 2x103 ТСID50/мл добавляли к каждой пробе и инкубировали в течение 60 ± 10 минут при комнатной температуре. Затем пробы переносили в 96-лу-ночные культуральные планшеты с однослойными культурами клеток А549. Цитопатический эффект (ЦПЭ) оценивали после инкубации культур в течение шести - восьми дней при температуре 37 °С в газовой смеси с 5%-ным СО2, а затем рассчитывали титр нейтрализации, как описано ранее [14].