Вакцина против вируса клещевого энцефалита на основе европейского прототипного штамма

03.11.2011

Клиническое исследование

В исходном исследовании (ClinicalTrials. gov. № NCT00161954) участвовали 60 здоровых взрослых добровольцев (возраст 16 - 65 лет). Всем участникам дважды ввели вакцину против КЭ ФСМЕ-Иммун в соответствии со схемой ускоренной иммунизации [15]. Примерно через 12 месяцев после второй дозы 44 участника получили третью дозу вакцины в рамках дальнейшего исследования (ClinicalTrials. gov. № NCT00163540; последующее исследование № NCT00161954). Для оценки реакции нейтрализации использовали образцы сывороток крови 41 участника, полученные на 21-й день после третьей вакцинации. Троих участников, которые перед третьей вакцинацией были серопозитивными на антитела к ВКЭ, исключили из исследования. Реакцию нейтрализации оценивали, как описано выше.

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ GraphPad Prism, версия 5.0. Результаты оценки реакции нейтрализации в отношении гибридных вирусов анализировали с применением одностороннего дисперсионного анализа, и достоверно значимую разность определяли с помощью критерия Тьюки.

Результаты и обсуждение

Конструирование гибридных вирусов «прототип ВКЭ/ВЛЗН»

Для конструирования гибридных вирусов использовали недавно полученный двухкомпонент-ный инфекционный клон штамма NY99 ВЛЗН [13] и прототипные штаммы ВКЭ европейского подтипа (Neudoerfl и К23), дальневосточного подтипа (Sofjin-HO и Oshima 5-10), сибирского подтипа (штамм Vasilchenko), а также отдаленно родственный штамм ВОГЛ (табл. 1). В гибридах последовательности ргМ и Е ВЛЗН были заменены на соответствующие последовательности ВКЭ, которые были встроены в капсид ВЛЗН, начиная с участка расщепления NS2B3 белков капсида и заканчивая участком NS1 сигналазного отщепления сигнальной последовательности (рис. 1). Таким образом были сохранены полная последовательность ргМ и Е ВКЭ и соответствующие сигнальные последовательности, что обеспечило возможность эффективной сборки вирусных частиц, которая зависит от согласованности процессов расщепления связи между С- и ргМ-кодирующими областями вирусной протеазой и сигналазой хозяина [16 - 18]. После трансфекции клеток Vero in vitro РНК-транскриптами, считанными с индивидуальных матриц кДНК, уже на пятый день после заражения обнаруживались высокие титры вирусных штаммов (см. табл. 1). Структуру генома гибридов подтверждали секвенированием гетерологичных последовательностей ргМЕ и фланкирующих областей. Для подтверждения ожидаемого фенотипа выявляли гетерологичный белок Е ВКЭ на частицах гибридного вируса. С этой целью гибрид ВКЭ-Nd/ ВЛЗН, штамм Neudoerfl ВКЭ и ВЛЗН NY99 анализи- ровали иммуноблоттингом с использованием поли-клональных антител против ВКЭ Neudoerfl и ВЛЗН NY99 (рис. 2). Как у ВЛЗН, так и у ВКЭ белки Е появлялись в виде одиночной полосы в диапазоне 50 - 60 кДа. Перекрестной реактивности антител в этом анализе не было обнаружено. Белки Е гибридных вирусов обнаруживались только при обработке сыворотками, содержащими антитела против ВКЭ, что указывало на наличие белка Е ВКЭ в собранном вирусном материале.

Конструкция Гибрид Подтип ВКЭ Инвентарный номер GenBank* Полученныйтитр,
log10 TCID50/мл
Гомологичность белка Е,
n/N (%)**
ВКЭ-Мс1/ВЛЗН Neudoerfl Европейский TEU27495 9,29 496/496(100)
ВКЭ-К23/ВЛЗН К23 Европейский АМ600965 8,64 492/496 (99)
КВЭ-Sofjin НО/ВЛЗН Sofjin НО Дальневосточный АВ062064 8,26 475/496 (96)
ВКЭ-Oshima 5-10/ВЛЗН Oshima 5-10 Дальневосточный АВ062063 8,38 475/496 (96)
ВКЭ-УазИсИепко/ВЛЗН Vasilchenko Сибирский AF069066 7,11 477/496 (96)
ВКЭ-ОтзкНР/ВЛЗН Omsk HF Н/п NC_005062.1 7,23 462/496 (93)

Примечание: н/п - неприменимо; ТСID50 - медиана инфекционной дозы культуры ткани.

* Инвентарные номера GenBank соответствующих штаммов ВКЭ «дикого» типа.

** Идентичность аминокислотной последовательности белка Е по сравнению с аминокислотной последовательностью белка Е штамма Neudoerfl ВКЭ, п (идентичные) / N (всего).

Таблица 1. Созданные гибриды