Вакцина против вируса клещевого энцефалита на основе европейского прототипного штамма

03.11.2011
Конструирование гибридных вирусов

Примечание: А. Схематическое изображение генома вируса лихорадки Западного Нила (ВЛЗН) ЫУ99(масштаб не соблюден). Темно-серыми прямоугольниками обозначены части структурных вирусных белков, светло-серыми прямоугольниками -части неструктурных белков; черные линии на 5'- и З'-концах обозначают некодирующие области (НКО). Уникальный сайт рестрикции SphI указывает на место соединения последовательности ВЛЗН, встроенной в 5'- и 3'-фланкирующие плазмиды соответственно. Показано положение сайтов рестрикции Muni и BshTI, использующихся для замены кодирующей области поверхностных белков ргМ и Е.

Б. Последовательности ВЛЗН между сайтами рестрикции Muni и BshTI были заменены на фрагменты гена, кодирующего отдельные области ргМЕ вируса клещевого энцефалита (ВКЭ), окруженные последовательностями ВЛЗН; указаны точные места соединения между последовательностями ВЛЗН и ВКЭ.

Рисунок 1. Конструирование гибридных вирусов

Кинетика роста гибрида Neudoerfl в различных клеточных линиях

Фенотипический анализ прототипа гибридного штамма Neudoerfl ВКЭ

Примечание: BK3-Nd/Bfl3H сравнивали со штаммами «дикого» типа ВЛЗН NY99 и Neudoerfl ВКЭ с помощью иммуноблоттинга. Использовали поликлональные мышиные сыворотки, содержащие антитела против ВЛЗН NY99 или штамма Neudoerfl ВКЭ соответственно.

Рисунок 2. Фенотипический анализ прототипа гибридного штамма Neudoerfl ВКЭ

Для сравнения репликативной способности гибридных вирусов и соответствующих штаммов «дикого» типа анализировали индивидуальную кинетику роста. Прототипным штаммом в этом анализе послужил гибрид ВКЭ-Nd/ВЛЗН, несущий оба родительских вируса. Клетки млекопитающих (Vero, А549) и комаров (С6/36) инфицировали с МЗ 0,0001, после чего определяли вирусные титры в сроки, указанные на рисунке 3. Для титрования надосадочной жидкости были выбраны клетки Vero (платформа титрования ВЛЗН) и А549 (платформа титрования ВКЭ). Анализ кинетики роста штамма Neudoerfl ВКЭ с помощью платформы титрования А549 показал умеренную репликацию в клетках Vero, достаточный рост в клетках А549 и отсутствие роста в клетках C6/36 (см. рис. 3, правую колонку). В связи с тем что штамм Neudoerfl ВКЭ не вызывал ЦПЭ в клетках Vero, титры штамма Neudoerfl ВКЭ не могли быть определены с использованием клеток Vero в качестве детектора (см. рис. 3, левую колонку). ВЛЗН NY99 активно размножался во всех клеточных линиях, с более высокими абсолютными титрами в клетках Vero в сравнении с клетками А549. В отличие от обоих вирусов «дикого» типа, при титровании гибридных штаммов BKЭ-Nd/BЛЗH были обнаружены сходные титры независимо от платформы титрования. Скорость роста этого гибрида в сравнении с ВЛЗН NY99 в клетках млекопитающих была медленнее на ранних сроках (1 - 56 часов), но максимальные титры были сходными. Интересно, что в клетках C6/36 рост гибридных штаммов BKЭ-Nd/BЛЗH замедлялся, что указывает на вероятное нарушение функции поверхностных белков ВКЭ в отношении захвата вирусов клетками комаров. Напротив, в клетках Vero гибридный штамм реплицировался гораздо активней, чем штамм «дикого» типа Neudoerfl ВКЭ, что указывает на полное сохранение функций поверхностных белков ВКЭ и ограниченную способность к репликации неструктурных белков в данной клеточной системе. Можно заключить, что клеточная линия А549 представляет собой наиболее подходящую си- стему для анализа роста и титрования гибридных вирусов in vitro, так как кинетика репликации и титры гибридных штаммов BKЭ-Nd/BЛЗH (с замененными поверхностными белками) существенно не отличались от соответствующих показателей для штаммов «дикого» типа Neudoerfl ВКЭ и ВЛЗН NY99.