Выявление маркеров аттенуации

03.02.2012

Перевиваемую линию клеток Vero культивировали в питательной среде MEM (Invitrogen, США) в присутствии 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (Ну Clone, США), 1 ммоль глютами-на (Invitrogen, США) и 100 мкг/мл гентамицина (Invitrogen, США), в матрасах на 650 мл (Greiner Bio-one, Австрия) при +37 °С и 5% СО2.

Отечественный штамм вируса краснухи С-77: дикий вариант (wt) (6 пассажей) и аттенуированный вариант (са) (39 пассажей).

Зараженные культуры инкубировали семь дней при 33 °С, 39 °С и 5%-ном СО2. Ежедневно отбирали аликвоту вируссодержащей жидкости, осветляли центрифугированием при 3000 об./мин в течение 10 минут и хранили при -70 °С.

Количественное определение вируса краснухи методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) проводили, как указано в статье Ю.И. Забияки с соавт. [2]. Из исследуемых образцов и образцов калибраторов (образцы с известным титром вируса) выделяли вирусную РНК с помощью набора реагентов ZR Viral RNA Kit (Zymo Research, США) или Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Германия) и проводили реакцию обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР-РВ с вирус-специфическими праймерами и зондом. Результат количественной ПЦР-РВ высчитывали по отношению к контрольному образцу с присвоенной специфической активностью, выраженной в lgTЦД50/мл, и вследствие этого также выражали в lgTЦД50/мл.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Все вычисления осуществлялись с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel.

Результаты и обсуждение

С целью генотипирования выделенного штамма вируса краснухи С-77 было проведено секвениро-вание участка Е1 генома wt- и са-вариантов вируса размером 1442 нуклеотида.

С помощью программы Vector NTI Advance 9.0 был проведен филогенетический анализ полученных нуклеотидных последовательностей, в результате которого варианты вируса краснухи С-77 были отнесены к генотипу 1h [1].

В исследовании был проведен анализ интенсивности репродукции wt- и са-вариантов штамма С-77 при различных температурных режимах (33 °С, 39 "С) с использованием нового метода количественного определения вируса на основе ПЦР-РВ. Классические методы количественной оценки вируса краснухи - реакция бляшкообразования и реакция цитопатического действия - обладают рядом недостатков, такими как длительность теста (около 12 дней), трудоемкость, а также субъективность в интерпретации результатов. В работе [2] была показана высокая степень корреляции между результатами определения титра вируса краснухи по реакции ЦПД и ПЦР-РВ при соблюдении определенных условий.

Для получения образцов вируссодержащей жидкости культуру клеток Vero инфицировали вирусом краснухи с множественностью заражения 0,01 инфекционной единицы на клетку. Сбор вирусного материала проводили на третьи - седьмые сутки после заражения и определяли титр вируса методом ПЦР-РВ.