Апробация в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата

04.04.2012

Этап 1. Подготовка культуры клеток 293Т/17 для проведения котрансфекции и получения псевдовирусов ВИЧ

Материалы: перевиваемая линия клеток 293Т/17; ФБР (фосфатный буферный раствор); среда «Игла», модифицированная DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GiBCO/invitrogen, США); MEM Non-Essetial Amino Acids Solution (10 ммоль), NAA (a-naphthaleneacetic acid), GiBCO/invitrogen, США; антимикотик (амфотерицин В, стрептомицин, пенициллин G), ООО «Биолот», Санкт-Петербург; сыворотка крови плодов коровы, invitrogen, США; раствор трипсина с ЭДТА.

Оборудование: термостат, инвертированный микроскоп.

Работа с культурой клеток 293Т/17: для наращивания культуры клеток 293Т/17 использовалась ростовая среда, состоящая из DMEM, амфотери-цина В, стрептомицина и пенициллина, с добавлением раствора аминокислот MEM Non-Essential Amino Acids Solution и 10%-ной сыворотки крови плодов коровы. Стерилизовали ростовую среду фильтрованием (фильтр 0,22 мкм). Удаляли питательную среду с монослоя клеток в культуральном флаконе Т25, после чего добавляли раствор трип-син-ЭДТА, инкубировали 30 - 45 секунд при комнатной температуре, затем удаляли раствор трипсина и инкубировали при 37,0 ± 0,2 °С в течение трех минут. Прибавляли 10 мл ростовой среды и ресуспендировали клетки пипетированием. Проводили подсчет концентрации клеток и засевали в новый культуральный флакон Т25 по 300 тыс. клеток в 5 мл ростовой среды. Продолжали инкубацию при 37 оС в течение трех суток.

Этап 2. Проведение котрансфекции и получение псевдовирусов

Материалы: рекомбинантные плазмидные ДНК: 1) PVO, клон 4 (SVPB11), формирующая псевдовирусные частицы с низкой чувствительностью к нейтрализации, 2) SF162.LS, формирующая псевдовирусные частицы с высокой чувствительностью к нейтрализации, и 3) pSG3delta Env, содержащая геном ВИЧ-1, дефектный по гену оболочечного гликопротеина gp160; трансфектант ExGen 500; физиологический раствор; поддерживающая среда DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), содержащая амфотерицин В, стрептомицин 500 мг, пенициллин G (500 000 ЕД), 250 мкл MEM Non-Essential Amino Acids Solution (10 ммоль).

Сток Env-типированных псевдовирусов нарабатывали в культуре клеток 293Т/17 путем котранс-фекции двух плазмид, одна из которых содержит ген Env, кодирующий оболочечные белки ВИЧ-1, а другая - геном ВИЧ-1, за исключением гена Env. Только Env-минус-плазмида pSG3delta Env способна реплицироваться в клетках 293Т/17, и она участвует в упаковке псевдовириона, чтобы доставить tat-ген в клетки TZM-bl. Таким образом, котрансфекция клеток 293Т/17 вышеуказанными плазмидами формирует потомство инфекционных псевдовирусных частиц, которые не способны воспроизводиться.

Проведение котрансфекции: в двух стерильных микропробирках готовили смесь реагентов - двух плазмидных ДНК и трансфектанта ExGen 500 («Хеликон», Москва), перемешивали содержимое микропробирок с плазмидами и ExGen 500 на «Вортексе», инкубировали при комнатной температуре 10 минут для образования комплекса плазмид с ExGen 500. Добавляли содержимое обеих микропробирок (комплекс плазмид с ExGen 500) в куль-туральный флакон с клетками 293Т/17. Инкубировали клетки с комплексом три часа в термостате при 37,0 ± 0,2 °С. Затем в культуральный флакон добавляли ростовую среду и инкубировали при 37,0 ± 0,2 °С двое-трое суток. После окончания инкубации супернатант культуры клеток 293Т/17 центрифугировали, чтобы осадить клетки и клеточный детрит. Полученную суспензию псевдовирусных частиц стерилизовали фильтрованием через фильтр с размером пор 0,45 мкм и разливали в стерильные пробирки.