Апробация в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата

04.04.2012

Этап 3. Определение инфекционной активности псевдовирусов и подбор рабочей дозы псевдовируса для реакции нейтрализации (РН)

Материалы: культура перевиваемых клеток TZM-bl; псевдовирус SF162; псевдовирус PVO4; поддерживающая среда для культивирования клеток DMEM, амфотерицин В, стрептомицин, пенициллин, 96-луночный культуральный планшет; ДЕАЕ-декстран; 96-луночный микропланшет для люминометрии; набор для выявления люцифера-зы (Dual-Luciferase Reporter 1000 Assay System, Promega, США): лизирующий буфер и реагент (субстрат) для выявления люциферазы светлячка.

Оборудование: люминометр планшетный, термостат, инвертированный микроскоп.

Для постановки реакции нейтрализации используется псевдовирус с инфекционной активностью 100 TCiD50. Поэтому после получения стока псевдовирусов необходимо измерить их инфекционную активность с целью определения рабочего разведения псевдовируса.

Измерение инфекционности: на поддерживающей среде готовили пятикратные разведения псевдовирусов до 11-го разведения, после чего смешивали с равным объемом суспензии клеток TZM-bl в концентрации 15 000 клеток/100 мкл в ростовой среде. Инкубировали микропланшет 48 часов при температуре 37,0 ± 0,2 °С в ат- мосфере 5%-ного СО2. После окончания инкубации промытые клетки разрушали с использованием лизирующего буфера (Bioscience Pharmingen (кат. № 51-56871), США) и переносили по 30 мкл ли-зата в соответствующие лунки 96-луночного микропланшета для измерения люминесценции, затем вносили по 100 мкл реагента для выявления люциферазы и незамедлительно проводили учет люминесценции в планшетном люминометре. Рассчитывали значение TCiD50 по методу Рида-Менча, при этом лунки, в которых люминесценция меньше, чем трехкратный фоновый сигнал от культуры клеток, считаются отрицательными.

Этап 4. Нейтрализация псевдовирусов ВИЧ-1 иммунными сыворотками

Материалы: сыворотки крови мышей линии BALB/С, иммунизированных сериями вакцины КомбиВИЧвак двукратно с интервалом 28 суток; референс-сыворотки - сыворотка К(+), полученная от ВИЧ-инфицированного, обладающая нейтрализующей активностью, и сыворотка К(-), не обладающая ВИЧ-нейтрализующей активностью; для постановки РН использовались те же реагенты, материалы и оборудование, что и указанные в пункте 3.

Величина вируснейтрализующей активности исследуемого образца сыворотки крови мышей измеряется как обратное значение его разведения, при котором достигается 50%-ное подавление вирус-индуцированной люминесценции в сравнении с люминесценцией только псевдовируса без добавления исследуемой сыворотки.

Постановка реакции нейтрализации: в поддерживающей среде готовили трехкратные разведения сывороток, включая контрольные образцы.

Готовили сток с псевдовирусами SF162 и PVO4 таким образом, чтобы обеспечить инфекционную активность в лунке, равную 100 TCID50, после добавления суспензии псевдовируса и суспензии клеток TZM-bl. Схема внесения образцов сыворотки и псевдовирусов приведена в таблице 2. Для каждого разведения исследуемой сыворотки использовали по два ряда лунок планшета: один - для псевдовируса SF162, другой - для псевдовируса PVO4. После смешивания псевдовируса и сыворотки закрывали планшет и инкубировали один час при температуре 37,0 ± 0,2 °С в атмосфере с 5%-ным СО2. Готовили суспензию TZM-bl-клеток и вносили по 15 000 клеток в каждую лунку планшета. Планшет инкубировали 48 часов при температуре 37,0 ± 0,2 °С в атмосфере с 5%-ным СО2. После окончания инкубации промытые клетки разрушали с помощью лизиру-ющего буфера (Bioscience Pharmigen (кат. № 5156871), США) и переносили по 30 мкл лизата в соответствующие лунки 96-луночного микропланшета для измерения люминесценции, затем вносили по 100 мкл реагента для выявления люциферазы и незамедлительно проводили учет люминесценции в планшетном люминометре.