Апробация в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата

04.04.2012

Этап 5. Учет и обработка результатов нейтрализации псевдовирусов ВИЧ-1

Нейтрализация псевдовируса каждым разведением сыворотки определялась разностью показателей люминесценции в измеряемой лунке (клетки + сыворотка + вирус) и усредненного значения по контрольным лункам (только клетки) и делением этой разности на разность между усредненными показаниями люминесценции вирусного контроля (вирус + клетки) и контроля клеток (только клетки); полученное частное умножается на 100% с использованием формулы:

 Нейтрализация (%) = 100% х (RLUкл. + сыв. + вир. - RLUкл.) / (RLUкл. + вир. - RLUкл.)

, где RLU - интенсивность люминесценции в лунке в относительных единицах.

Псевдовирус SF162 PVO4 SF162 PVO4 SF162 PVO4 SF162 PVO4 SF162 PVO4
Сыворотка № 1 № 1 № 2 № 2 № 3 № 3 К(+) К(+) К(-) К(-)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A SF162 PVO4 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734 1:44 734
B SF162 PVO4 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911 1:14 911
C SF162 PVO4 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970 1:4970
D SF162 PVO4 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657 1:1657
E SF162 PVO4 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552 1:552
F Клетки Клетки 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184 1:184
G Клетки Клетки 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61 1:61
H Клетки Клетки 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20 1:20

Таблица 2. Схема внесения в лунки микропланшета проб исследуемых сывороток и контролей для измерения ВИЧ-нейтрализующей активности сывороток (в ячейках указаны разведения исследуемой сыворотки)

Титр нейтрализующих антител IC50 (50% inhibition concentration) выражается в обратной величине разведения сыворотки, при которой обеспечивается 50%-ное подавление люминесценции. Если известна концентрация общего IgG в исследуемой сыворотке, то IC50 можно выражать в мкг/мл общего IgG, что позволит сравнивать полученные данные с результатами, известными и опубликованными данными IC50 для широко нейтрализующих моно-клональных антител или других нейтрализующих антител. Расчет показателя IC50 и его 95%-ного доверительного интервала проводится методом про-бит-анализа с использованием результатов измерения нейтрализации (%) для каждого из восьми разведений сыворотки. Величина интенсивности люминесценции для образцов ненейтрализующей контрольной сыворотки К(-) должна укладываться в пределы 95%-ного доверительного интервала, определенного для вирусного контроля (вирус + клетки).