Апробация в доклинических испытаниях метода определения вируснейтрализующей активности вакцины-кандидата

04.04.2012

Полученные с помощью технологии использования псевдовирусов данные подтверждаются результатами исследований, проведенных ранее с живым вирусом [2, 3], когда постановка реакции вируснейтрализации заключалась в определении in vitro нейтрализующих свойств сывороток крови иммунизированных вакциной лабораторных животных на модели острой инфекции референс-штаммом ВИЧ-1 в перевиваемых лимфоидных клетках человека МТ-4. Нейтрализующая активность антител определялась по ингибированию вирусной инфекции, путем измерения содержания р24-антигена ВИЧ-1 в культуральной жидкости с помощью ИФА [1, 4]. Этот метод измерения нейтрализации ВИЧ зависит от способности вируса, адаптированного к Т-клеточной линии, инфицировать эту линию, производить детектируемые вирусные белки или формировать гигантские клетки (синцитии), что в конечном итоге можно было количественно выразить как меру уменьшения инфекции под воздействием антител. Метод достаточно простой при постановке, однако обладает рядом недостатков, в первую очередь связанных с тем, что в этом случае в реакции используется один и тот же адаптированный лабораторный штамм вируса. Изучение нейтрализации одного штамма ВИЧ-1 не обеспечивает полного представления о нейтрализующей, протективной активности сывороток крови животных или человека, иммунизированных вакциной против ВИЧ, против других актуальных штаммов ВИЧ, многообразие которых определяется их антигенной изменчивостью, и нейтрализация вирусов, адаптированных к культуре Т-клеток, очень плохо предсказывает нейтрализующие свойства первичных ВИЧ-изолятов.

Технология, основанная на использовании псевдовирусов, лишена вышеуказанных недостатков. Она позволяет работать с вирусными частицами из множества вирусных субтипов, используя простые и безопасные реагенты, обеспечивает высокий уровень воспроизводимости и производительности.

Метод оценки вируснейтрализующей активности образцов иммунных сывороток с использованием псевдовирусов ВИЧ-1, полученных на культуре клеток 293Т/17, и проведение теста нейтрализации в культуре клеток TZM-bl c учетом люминесценции люциферазы занимает примерно 10 - 12 суток. Метод, несмотря на большую продолжительность и проведение в пять этапов до получения результатов, достаточно точен и воспроизводим. Полученные псевдовирусы имеют только один цикл размножения, работа с ними не требует особых условий защиты исследователя.

При внедрении данного метода в других научно-исследовательских лабораториях для оценки вируснейтрализующей активности необходимо выполнить следующие рекомендации:

Культуры клеток 293Т/17 и TZM-bl должны быть паспортизированы, на их основе должны быть приготовлены, аттестованы и заложены на хранение рабочие банки клеток.

Рекомбинантные плазмиды, используемые при котрансфекции для наработки псевдовирусов, также следует охарактеризовать, изучить их стабильность и заложить на хранение.

Для сокращения времени и упрощения постановки теста нейтрализации сывороток целесообразно вышеуказанные пять этапов постановки теста свести к двум:

  • получение псевдовирусов ВИЧ-1 на культуре клеток 293Т/17, изучение условий хранения и стабильности готовых псевдовирусов, включая лиофильное высушивание; определение инфекционной активности при одном цикле инфекции в культуре клеток TZM-bl, закладка этих псевдовирусов на хранение и распределение их между организациями - участниками клинических испытаний вакцины ВИЧ-1;
  • проведение теста нейтрализации в течение одного рабочего дня с использованием стандартизованных псевдовирусных реагентов и исследуемых сывороток в культуре клеток TZM-bl с учетом инфекционности по уровню люминесценции.

Наряду с расчетом величины ВИЧ-нейтра-лизующего титра сыворотки следует проводить нормировку на индивидуальный уровень общего иммуноглобулина и представлять результаты ВИЧ-нейтрализации в виде ингибирующей концентрации иммуноглобулинов IC50 в мкг/мл.