Генетические и биологические свойства оригинальной группы штаммов вируса клещевого энцефалита

02.06.2012

Терморезистентность 50) штаммов ВКЭ изучали по методу Э.А. Овчинниковой и др. [17] с использованием суточной культуры клеток СПЭВ, выращенной в 96-луночных планшетах в атмосфере CO2. Уровень терморезистентности оценивали по индексу инактивации - разнице Ig титров прогретого при 50 °С в течение 15 мин и непрогретого (4 °С) вируса. При разнице титров ≤ 2,0 Ig штамм оценивали как Т50+, от 2,1 до 3,0 Ig - как промежуточный, > 3,1 Ig - как Т50-.

Rct42-признак (способность вируса к репродукции при супраоптимальной температуре). Для определения rct42 суточную культуру клеток СПЭВ, выращенную в 96-луночных планшетах, заражали десятикратными разведениями вируссодержащей суспензии (с 10-1 до 10-10). Часть клеточных культур, зараженных одним штаммом, инкубировали при 37 °С, другую часть, зараженную тем же штаммом, инкубировали при 42 °С в атмосфере СО2. Признак rct42 определяли на 6-й день после заражения и оценивали по разнице Ig титров вируса при культивировании штаммов на культуре клеток СПЭВ при температуре 37 и 42 °С. При разнице титров < 2,0 Ig штамм оценивали как rct42+, от 2,1 до 3,0 Ig - как промежуточный, ≥ 3,1 Ig - как rct42-.

S-признак. Культуру клеток СПЭВ заражали штаммами ВКЭ, прошедшими не более 4-х пассажей через мозг белых мышей и трехкратное клонирование. Бляшки появлялись на 3 - 4-е сутки. Учет размера бляшек проводился на 5-е сутки после заражения, когда бляшки увеличивались в размере и становились более отчетливыми и прозрачными. S-признак учитывался как S+ при диаметре бляшки (d) ≥ 2,5 мм; S+- при 2,5 > d ≥ 2,0; S- - при 2,0 > d ≥ 1,0.

Результаты и обсуждение

Впервые необычность штамма 886-84 ВКЭ была выявлена при изучении его серологических свойств. А.Г Трухиной был сделан вывод о том, что данный штамм занимает промежуточное положение между двумя серотипами ВКЭ - восточно-сибирским и дальневосточным и обладает свойствами обоих серотипов [21].

В дальнейшем штамм 886-84 был описан нами как представитель самостоятельного генотипа в соответствии с критериями, выведенными нами на основе сравнения уровня отличий фрагмента гена Е (нуклеотидные позиции 567 - 727) у 29 штаммов, изолированных в различных частях ареала ВКЭ [8]. Оказалось, что при анализе гомологии аминокислотных последовательностей соответствующего фрагмента белка Е длиной 53 а.о. штамм 886-84 примыкает к генотипу 3. Он имеет в позиции 206 лейцин, как и все штаммы этого генотипа, а в позиции 234 - аминокислоту аспарагин, как и генотипы 1 и 2 [10]. Исходя из этого, а также по причине того, что гомологичные ему изоляты на тот момент не были обнаружены, мы посчитали, что для выделения этого штамма вируса в отдельный генотип необходимо получение дополнительных данных.

Сопоставление полного генома штамма 886-84 (EF469662) с последовательностями ВКЭ, имеющимися в GenBank, показало, что на филогенетических деревьях он образует самостоятельную ветвь, не входя в состав кластеров трех основных генотипов (рис. 1), и по уровню нуклеотидных и аминокислотных замен также «приближается к границе разделения генотипов» [11] (табл. 2).

Анализ полной аминокислотной последовательности генома штамма 886-84 подтвердил, что его генетическая структура уникальна, она представляет собой «переплетение» из последовательностей, характерных для генотипов 1, 2 и 3. Например, в наборе из 22-х позиций, однозначно дифференцирующих известные штаммы ВКЭ на три основных генотипа, для штамма 886-84 обнаружено чередование собственных (или уникальных) аминокислот (аланин (А) в позиции С-108, серин (S) - NS2A-127 и глицин (G) - NS3-258) с аминокислотами, характерными для каждого из основных генотипов [7] (табл. 3).