Определение генетической структуры ротавирусов группы А

02.12.2012

Материалы и методы

В исследовании использованы 70 фекальных образцов, содержащих ротавирусы и собранных в больницах Москвы и Московской области в 2009 - 2011 годах от детей дошкольного возраста, госпитализированных с симптомами ОКИ. Отбор проводился по принципу случайной выборки из 260-ти положительных образцов, тестированных для обнаружения антигенов и РНК ротавирусов группы А с использованием набора «Ротавирус-антиген-ИФА-БЕСТ» («Вектор-Бест», Россия) и лабораторного набора реагентов на основе ПЦР-РВ с видоспецифическими праймерами [3]. Отобранные пробы были исследованы методом мультиплексной ПЦР-РВ с использованием праймеров и ДНК-зондов собственной разработки, направленных на дифференциальное выявление доминирующих в популяциях вариантов генов VP7 (G), VP4 (P), VP6 (I) ротавирусов группы А, а именно: G1, G2, G3, G4, G9, P4, P6, P8, I1, I2. При конструировании тест-системы для подбора праймеров, ДНК-зондов и общего генетического анализа использовались общедоступные биоинформационные ресурсы: GenBank NCBI, EMBL Nucleotide Sequence Database и др. Аналитические работы в автономном режиме выполнены с помощью программных продуктов Vector NTI Advance (Infomax, США), DNAStar (DNASTAR, США), MEGA5 (Япония, США).

Для выделения вирусной РНК использовались 10%-ные фекальные экстракты и набор ZR Viral RNA Kit (Zymo Research, США). Реакции обратной транскрипции (ОТ) и ПЦР-РВ проводили с использованием наборов «ОТ-1» и «2,5х Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ» («Синтол», Россия) на приборах «Терцик» и ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия). Реакции ОТ и ПЦР-РВ проводили с предварительной денатурацией вирусной РНК прогревом при 95 оС в течение 90 секунд в пробирках объемом 200 мкл согласно рекомендациям производителя наборов для ПЦР-РВ и ОТ.

Для достижения поставленной цели был решен ряд практических задач: сформирована коллекция биопроб, содержащих первично-охарактеризованные «дикие» штаммы ротавирусов; на базе геномных последовательностей, представленных в общедоступных международных базах данных, определены локусы, уникальные для вариантов каждого гена, и сконструированы специфические пары праймеров с ДНК-зондами.

Конструирование системы генотипирования проводилось путем подбора праймеров и зондов, гомологичных локусам сегментов генома, отвечающим условиям уникальности по критериям «вид» и «вариант гена», а также минимальной гомологии с вероятными контаминантами. В качестве вероятных контаминантов учитывались нуклеотидные последовательности геномов человека, кишечной микробиоты, возбудителей заболеваний, дающих сходную с ротавирусной инфекцией клиническую картину, а также типичные пищевые продукты, употребляемые населением обследуемого региона. За систему классификации генотипов ротавирусов группы А были приняты рекомендации ВОЗ [11] и международной инициативной Рабочей группы по классификации ротавирусов [8, 12].

Обоснованием выбора ПЦР-РВ в качестве метода генотипирования ротавирусов служат относительная простота его применения и оснащенность современных эпидемиологических лабораторий специализированным оборудованием для проведения ПЦР-РВ. Возможность автоматизации анализа и учета результатов выгодно отличает генотипи-рование методом ПЦР-РВ от описанного в текущих рекомендациях ВОЗ по генетической характеристике ротавирусов [11], предусматривающих электрофоретическое выявление результатов ПЦР.

Для дифференциального выявления 10 вариантов генов, кодирующих белки VP7 (G1, G2, G3, G4, G9), VP4 ([P4], [P6], [P8]) и VP6 (I1, I2), сформировано пять реакционных смесей, в каждой из которых выявляется по два варианта генов (табл. 1). Оптимизированы условия проведения мультиплексной ПЦР-РВ-системы генотипирования ротавирусов группы А. Проверка путем выборочного элетрофо-ретического анализа и секвенирования продуктов ПЦР, полученных на «диких» штаммах, показала соответствие размеров ампликонов ожидаемым, высокую степень гомологии нуклеотидных последовательностей исследованных штаммов референсным и соответствие результатов ПЦР-РВ-анализа вариантам генов ротавирусов, установленным секвени-рованием. При сравнении результатов типирова-ния ротавирусов методом ПЦР-РВ в моноспецифи-ческом и мультиплексном вариантах с одновременным электрофоретическим контролем размеров получаемых ампликонов различий между двумя вариантами постановки анализа и признаков конкуренции в реакционной смеси для мультиплексной ПЦР-РВ выявлено не было.