Евгений Михайлович Зайцев – доктор медицинских наук, заведующий лабораторией иммуномодуляторов.
105064, Москва, Малый Казенный переулок, д.5а. +7 (495) 916-22-63
Evgeny M. Zaytsev – Dr. Sci. (Med.), Head of the Laboratory of Immunomodulators.
Moscow, +7 (495) 916-22-63
Марина Васильевна Брицина – ведущий научный сотрудник.
Москва. +7 (495) 916-22-63
Marina V. Britsina – Leading Researcher.
Moscow, +7 (495) 916-22-63
Мария Николаевна Озерецковская – ведущий научный сотрудник.
Москва. +7 (495) 916-22-63
Maria N. Ozertskovskaya – Leading Researcher.
Moscow, +7 (495) 916-22-63
Ирина Глебовна Бажанова – ведущий научный сотрудник.
Москва. +7 (495) 916-22-63
Irina G. Bazhanova – Leading Researcher.
Moscow, +7 (495) 916-22-63
Актуальность. Рост заболеваемости коклюшем, высокий удельный вес тяжёлых форм заболевания, снижение чувствительности циркулирующих штаммов B. pertussis к антибиотикам требуют разработки более эффективных средств этиотропной терапии, в том числе способных влиять на биоплёночные формы возбудителя коклюша, отличающихся от планктонных клеток повышенной устойчивостью к иммунной системе хозяина и антибактериальным препаратам.
Цель. Изучение влияния трипсина и лидазы в сочетании с гентамицином на рост биоплёнок штаммов Bordetella pertussis на абиотическом субстрате.
Материалы и методы. В опытах использовали выделенные в РФ от больных коклюшем в 2001–2010 гг. штаммы B. pertussis: № 178 (серовар 1.2.0), № 287 (серовар1.0.3) и № 317 (серовар 1.2.3), выращенные на плотной питательной среде. Интенсивность образования биоплёнок в жидкой питательной среде в присутствии трипсина (10 мкг/мл), лидазы (20 МЕ/мл), гентамицина (2,0 мг/мл, 0,4 мг/мл и 0,08 мг/мл) и их сочетаний в круглодонных полистироловых 96луночных планшетах оценивали окрашиванием 0,1% раствором генцианфиолетового.
Результаты. Гентамицин частично подавлял формирование биоплёнок и вызывал частичное разрушение сформированных биоплёнок при отсутствии роста микробных колоний при посеве надосадочных жидкостей из биоплёночных культур на плотную питательную среду. Минимальная подавляющая концентрация гентамицина (МПК) составила 2 мг/мл. Трипсин полностью подавлял рост биоплёнок и вызывал полное разрушение сформированных биоплёнок. Лидаза также подавляла рост биоплёнок, однако менее эффективно влияла на сформированные биоплёнки. При посеве надосадочных жидкостей из биоплёночных культур в присутствии трипсина и лидазы на плотную питательную среду был отмечен рост типичных для B. pertussis колоний. Трипсин в сочетании со всеми исследованными концентрациями гентамицина полностью подавлял рост биоплёнок (МПК 0,08 мг/мл), а в сочетании с гентамицином в концентрации 2,0 мг/мл вызывал полное разрушении биоплёнок при отсутствии микробного роста на плотной питательной среде. Лидаза в сочетании со всеми исследованными концентрациями гентамицина также подавляла формирование биоплёнок (МПК 0,08 мг/мл), а в сочетании с гентамицином в концентрации 2,0 мг/мл вызывала частичное разрушение сформированных биоплёнок при отсутствии микробного роста на плотной питательной среде.
Заключение. Выявлен синергический эффект комбинаций трипсина и лидазы с гентамицином на растущие и сформированные биоплёнки штаммов B. pertussis. Совместное использование трипсина или лидазы с гентамицином позволило снизить его МПК для растущих биоплёнок в 25 раз. Наиболее выраженным эффектом в отношении сформированных биоплёнок отличалась комбинация трипсина с гентамицином в концентрации 2 мг/мл, вызывавшая их полное разрушение и гибель планктонных клеток. Эффект комбинации лидазы с гентамицином на сформированные биоплёнки был менее выраженным.
Relevance. An increase in the incidence of whooping cough, a high proportion of severe forms of the disease, and a decrease in the sensitivity of circulating strains of B. pertussis to antibiotics require the development of more effective etiotropic therapies, including those capable of influencing biofilm forms of the whooping cough pathogen, which differ from planktonic cells by increased resistance to the host immune system and antibacterial drugs.
Аim of the work is to study the effect of trypsin and lidase in combination with gentamycin on the growth of biofilms of Bordetella pertussis strains on an abiotic substrate.
Materials and methods. In the experiments B. pertussis strains isolated in the Russian Federation from whooping cough patients in 2001‒2010 were used: No. 178 (serotype 1.2.0), No. 287 (serotype 1.0.3) and No. 317 (serotype 1.2.3), grown on a dense nutrient medium. The intensity of biofilm formation in a liquid nutrient medium in the presence of trypsin (10 mcg/ml), lidase (20 IU/ml), gentamycin (2.0 mg/ml, 0.4 mg/ml and 0.08 mg/ml) and their combinations in roundbottomed polystyrene 96well plates was evaluated by staining with 0.1% gentianviolet solution.
Results. Gentamycin partially suppressed the formation of biofilms and caused partial destruction of the formed biofilms in the absence of growth of microbial colonies when sowing supernatants from biofilm cultures on a dense nutrient medium. The minimum suppressive concentration of gentamycin (MSC) was 2 mg/ml. Trypsin completely suppressed the growth of biofilms and caused the complete destruction of the formed biofilms. Lidase also suppressed the growth of biofilms, but less effectively affected the formed biofilms. The growth of colonies typical of B. pertussis was noted when sowing supernatants from biofilm cultures in the presence of trypsin and lidasе on a dense nutrient medium. Trypsin in combination with all the studied concentrations of gentamycin completely suppressed the growth of biofilms (MSC 0.08 mg/ml), and in combination with gentamycin at a concentration of 2.0 mg/ml caused complete destruction of biofilms in the absence of microbial growth on a dense nutrient medium. Lidase in combination with all the studied concentrations of gentamycin also suppressed the formation of biofilms (MSC 0.08 mg/ml), and in combination with gentamycin at a concentration of 2.0 mg/ml caused partial destruction of the formed biofilms in the absence of microbial growth on a dense nutrient medium.
Conclusion. The synergistic effect of the combination of trypsin and lidase with gentamycin on growing and formed biofilms of B. pertussis strains was revealed. The combined use of trypsin or lidase with gentamicin reduced its MSC for growing biofilms by 25 times. The most pronounced effect on the formed biofilms was the combination of trypsin with gentamycin at a concentration of 2 mg/ml, which caused their complete destruction and death of planktonic cells. The effect of the combination of lidase with gentamycin on the formed biofilms was less pronounced.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.