Ольга Николаевна Жигалева – руководитель научно-производственного отделения ПЦР
Московская область, г. Электрогорск
Ol'ga N. Zhigaleva – head of research and production department PCR
Elektrogorsk, Moscow Region
Сейфаддин Гашимович Марданлы – директор по науке, ЗАО «ЭКОлаб»
Московская область, г. Электрогорск
Seyfaddin G. Mardanly – head of science, CJSC «EKOlab»
Elektrogorsk, Moscow Region
Татьяна Юрьевна Гашенко – генеральный директор, ЗАО «ЭКОлаб»
Московская область, г. Электрогорск
Tat'yana Yu. Gashenko – general director, CJSC «EKOlab»
Elektrogorsk, Moscow Region
Илья Игоревич Ермолаев – лаборант, ЗАО «ЭКОлаб»
142530, Московская область, г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1
Il'ya I. Ermolaev – laboratory assistant, CJSC «EKOlab»
1 St. Budyonnogo, Hse., Elektrogorsk, Moscow Region, 142530
Актуальность. Гепатит В (ГВ) является одной из наиболее распространенных вирусных инфекций, поражающих людей во всем мире. ГВ может привести к хроническому гепатиту, циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме. В настоящее время 3% населения мира инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ) и подвержены риску развития опасных для жизни заболеваний печени. На сегодняшний день в лабораторной диагностике обнаружения ВГВ используют иммунологические и молекулярно-биологические методы. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) на сегодняшний день является высокочувствительным методом для обнаружения и количественной оценки содержания вируса гепатита В в организме человека. Количественное определение ДНК ВГВ необходимо для мониторинга эффективности противовирусного лечения инфекции.
Цель. Разработать набор ПЦР в режиме реального времени для количественного определения ДНК ВГВ.
Материалы и методы. В разработке использовано 200 образцов плазмы и сыворотки крови с положительным и отрицательным результатом на ВГВ. Сравнение разрабатываемого набора проводилось с использованием других коммерческих зарегистрированных на территории России наборов по диагностике вируса гепатита B. Дополнительно произведен анализ нуклеотидных последовательностей всех существующих генотипов вируса для подбора праймеров по системе GeneBank.
Результаты и обсуждение. Анализ результатов диагностической чувствительности разрабатываемого набора составляет 100%, специфичность – 100%. Разработанные праймеры были специфично подобраны в области гена POL. Набор способен выявлять все виды генотипов вируса.
Выводы. Разработанный набор реагентов позволяет проводить выявление вируса гепатита В и определять его количество в течение 70 мин. Помимо большого количества генотипов и субгенотипов, вирус характеризуется мутационными изменениями в геноме, что затрудняет его диагностику и, как следствие, проведение адекватной лекарственной терапии. В разработке были учтены консервативные области генома вируса для подбора праймеров и зондов, полученные последовательности применимы ко всем генотипам ВГВ. Набор реагентов разработан для мониторинга ВГВ-инфицированных пациентов и вирусной нагрузки во время проводимого лечения.
Relevance. Hepatitis B virus (HBV) is one of the most common viral infections affecting people worldwide and can lead to chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Currently 3% of the world's population are infected with hepatitis B virus and are at risk of developing life-threatening liver disease. Immunological and molecular biological methods of detection of HBV are currently used in laboratory diagnostics. The polymerase chain reaction (PCR) is currently the most sensitive method for the detection and quantification of HBV. HBV DNA quantification is widely used to monitor the antiviral treatment of HBV infection.
Aim. To develop a real-time PCR kit for the quantification of HBV DNA.
Materials and methods. A total of 200 plasma and serum samples positive and negative for HBV were used in the development. The performance of the developed kit was compared with the use of other commercially registered HBV diagnostic kits in Russia. Additionally, the nucleotide sequences of all existing virus genotypes analysed for the selection of primers using GeneBank system.
Results and discussion. Comparison analysis of the results of quantitative determination by real-time PCR in 200 clinical serum and blood plasma samples showed that the diagnostic sensitivity of the developed kit was 100% and specificity 100%. The primers developed specific to the POL gene region. The kit is capable of detecting all types of virus genotypes.
Conclusions. The developed reagent kit allows detection of hepatitis B virus and determination of its quantity within 70 minutes. In addition to a large number of genotypes and subgenotypes, the virus is characterized by mutational changes in the genome, which complicates its diagnosis and, as a consequence, the ongoing therapy with drugs. Conservative regions for primer and probe selection taken into account in the development, and the sequencing results obtained are applicable to all HBV genotypes. The reagent kit is designed to monitor HBV infected patients and will allow the analysis of different HBV viral loads.
The authors declare that there are no conflicts of interest present.