epidemiologyЭпидемиология и ВакцинопрофилактикаEpidemiology and Vaccinal Prevention2073-30462619-0494«Numicom» LLC10.31631/2073-3046-2024-23-1-41-50epidemiology-1938Research ArticleПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИPRACTICAL ASPECTS OF EPIDEMIOLOGY AND VACCINE PREVENTIONТрансмиссионная электронная микроскопия биопленок Vibrio cholerae на хитин-содержащих субстратахTransmission Electronic Microscopy of Vibrio cholerae Biofilms on Chitin-Containing Substrateshttps://orcid.org/0000-0002-7831-841XТитоваС. В.TitovaS. V.

Светлана Викторовна Титова – к. м. н., ведущий научный сотрудник лаборатории природно-очаговых и зоонозных инфекций,

Ростов-на-Дону,

тел.+7 (863) 240-91-08.

Svetlana V. Titova – Cand. Sci. (Med.), leading researcher, laboratories of natural focal and zoonotic infections,

Rostov-on-Don,

tel. +7 (863) 240-91-08.

titova_sv@antiplague.ruhttps://orcid.org/0000-0001-8261-2294СимоноваИ. Р.SimonovaI. R.

Ирина Рафиковна Симонова  – старший научный сотрудник лаборатории диагностических препаратов,

Ростов-на-Дону.

Irina R. Simonova – senior Researcher, laboratories of diagnostic preparations,

Rostov-on-Don.

https://orcid.org/0000-0002-6003-4283МеньшиковаЕ. А.MenshikovaE. A.

Елена Аркадьевна Меньшикова – к. б. н., с. н. с. отдела микробиологии холеры и других острых кишечных инфекций,

Ростов-на-Дону. 

Elena A. Menshikova  – Cand. Sci. (Biol.), senior researcher Department of  Microbiology of  cholera and other acute intestinal infections,

Rostov-on-Don.

ОсадчаяВ. С.OsadchayaV. S.

Виктория Сергеевна Осадчая – лаборант-исследователь лаборатории природно-очаговых и зоонозных инфекций, 

Ростов-на-Дону.

Victoria S. Osadchaya – laboratory assistant of the laboratories of natural focal and zoonotic infections, 

Rostov-on-Don.

ФКУЗ Ростовский-на-Дону Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт РоспотребнадзораРоссияFKUZ Rostov-on-Don of the Order of the Red Banner of Labor Research Anti-Plague Institute of RospotrebnadzorRussian Federation2024010320242314150Copyright © Титова С.В., Симонова И.Р., Меньшикова Е.А., Осадчая В.С., 20242024Титова С.В., Симонова И.Р., Меньшикова Е.А., Осадчая В.С.Titova S.V., Simonova I.R., Menshikova E.A., Osadchaya V.S.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.epidemvac.ru/jour/article/view/1938

Актуальность. Эволюционно сложившаяся ассоциация Vibrio cholerae с хитином обеспечила устойчивость к стрессовым воздействиям и защиту от хищников. Образование биопленки служит важнейшим механизмом создания эффективной ассоциации холерного вибриона с хитином. Способность формировать биопленку у V. cholerae зависит от наличия токсинкоррегулируемых пилей адгезии (TCP), за синтез которых отвечают гены tcp A-F. Одним из ключевых методов исследования биопленок является микроскопия. Она позволяет визуализировать структурные элементы и изучать различные параметры биопленок и эффекты воздействия на них различных факторов. Цель. Определение эпидзначимости биопленкообразующей способности токсигенных штаммов по их морфологическим особенностям на хитин-содержащих субстратах. Изучение структурных различий биопленок холерных вибрионов tcpA+ и tcpA– штаммов на хитин-содержащих субстратах. Материалы и методы. В исследовании использованы штаммы холерных вибрионов, разные по токсигенности и происхождению. В своей работе мы применили трансмиссионную электронную микроскопию для оценки эпидзначимости процесса биопленкообразования V. cholerae на хитин-содержащих субстратах. Результаты. Показано, что холерные вибрионы tcpA+ и tcpA– штаммов способны образовывать биопленки на поверхности хитин-содержащих субстратов. Интенсивность образования биопленок более выражена у tcpA+ штаммов, т.к. клетки V. cholerae ctxA+ tcpA+ в составе биопленки располагаются преимущественно одиночно и поверхность хитинового экзоскелета, с которой они контактируют, интактна, клетки V. cholerae ctxA– tcpA– в составе биопленки образуют цепочки, что указывает на процессы деления, а разрозненный хитин эндокутикулы свидетельствует об активности метаболических процессов. Заключение. Используемые в работе штаммы V. cholerae, независимо от наличия или отсутствия генов ctx и tcp, образуют биопленки на хитиновом субстрате. Показатель биопленкообразования по толщине матрикса биопленки выше у V. cholerae ctxA+ tcpA+ , по степени деградации хитинового субстрата выше у V. cholerae ctxA– tcpA– . Холерные вибрионы, имеющие ген tcpA, обладают большей интенсивностью биопленкообразования, что, в свою очередь, указывает на эпидемическую значимость феномена биопленкообразования и свидетельствует о важной роли хитина для персистенции холерных вибрионов в условиях гидробиоценозов водоемов и возможности выживания и сохранения эпидемически значимых штаммов.

Introduction. The evolutionary association of Vibrio cholerae with chitin provided resistance to stress and protection from predators. The most important mechanism that provided V. cholerae with the effectiveness of association with chitin is biofilm formation. The ability to form a biofilm in V. cholerae depends on the presence of a factor, toxin-corrected adhesion pili (TCP), which are synthesized by the tcp A-F genes. One of the key methods for studying biofilms is microscopy. It allows one to visualize the structural elements and study various parameters of biofilms and the effects of various factors on them. Aim. To determine the epidemiological significance of the biofilm-forming ability of toxigenic strains by their morphological characteristics on chitin-containing substrates. Study of structural differences in biofilms of Vibrio cholerae tcpA+– and tcpA– strains on chitin-containing substrates. Results. It has been shown that Vibrio cholerae tcpA+– and tcpA– strains are able to form biofilms on the surface of chitin-containing substrates. The intensity of biofilm formation is more pronounced in tcpA+ strains, because V. cholerae ctxA+ tcpA+ cells in the biofilm are predominantly singly located and the surface of the chitinous exoskeleton with which they are in contact is intact, V. cholerae ctxA– tcpA– cells form chains in the biofilm, which indicates division processes, and scattered chitin of the endocuticle indicates activity of metabolic processes. Conclusion. The strains of V. cholerae used in the work, regardless of the presence or absence of the ctx and tcp genes, form bioplecs on a chitin substrate. The indicator of biofilm formation in terms of the thickness of the biofilm matrix is higher in V. cholerae ctxA+ tcpA+ , in terms of the degree of degradation of the chitin substrate it is higher in V. cholerae ctxA– tcpA– .

биопленкаVibrio choleraхитинтрансмиссионная электронная микроскопияbiofilmsVibrio cholerachitintransmission electron microscopyАвторы выражают искреннюю благодарность научному сотруднику Головину Сергею Николаевичу, за непосредственное участие в подготовке проб для трансмиссионной электронной микроскопии.ReferencesSilva A.J., Benitez J.A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis // PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016. Vol. 10, N2. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004330Silva AJ, Benitez JA. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis. PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016;10(2). DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004330Rahman H., Mahbub K.R., Vergara G.E., et al. Protozoal food vacuoles enhance transformation in Vibrio cholerae through SOS-regulated DNA integration // The ISME Journal. 2022. Vol. 16. Р. 1993–2001. DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01249-0Rahman H., Mahbub K.R., Vergara G.E., et al. Protozoal food vacuoles enhance transformation in Vibrio cholerae through SOS-regulated DNA integration. The ISME Journal. 2022;16:1993–2001. DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01249-0Pruzzo C., Vezzulli L, Colwell R.R. Global impact Vibrio cholerae interactions with chitin // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10. P. 1400–1410. DOI: 10.1111/j.1462-2920.2007.01559.xPruzzo C., Vezzulli L, Colwell R.R. Global impact Vibrio cholerae interactions with chitin. Environ. Microbiol. 2008;10:1400–1410. DOI: 10.1111/j.1462-2920.2007.01559.xVezzulli L, Guzman C.A., Colwell R.R., Pruzzo C. Dual role colonization factors connecting Vibrio cholerae’s lifestyles in human and aquatic environments open new perspectives for combating infectious diseases // Curr. Opin. Biotechnol. 2008. Vol. 19. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2008.04.002Vezzulli L, Guzman C.A., Colwell R.R., Pruzzo C. Dual role colonization factors connecting Vibrio cholerae’s lifestyles in human and aquatic environments open new perspectives for combating infectious diseases. Curr. Opin. Biotechnol. 2008;19. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.copbio.2008.04.002Vezzullia L., Grandea C., Reidb P.C., et al. Climate influence on Vibrio and associated human diseases during the past half-century in the coastal North Atlantic. Proc Natl Acad Sci USA. 2016. Vol. 23, N113(34). P 5062–5071. DOI: 10.1073/pnas.1609157113Vezzullia L., Grandea C., Reidb P.C., et al. Climate influence on Vibrio and associated human diseases during the past half-century in the coastal North Atlantic. Proc Natl Acad Sci USA. 2016;23;113(34): 5062–5071. DOI: 10.1073/pnas.1609157113Меньшикова Е. А., Курбатова Е. М., Титова С. В. Экологические особенности персистенции холерных вибрионов: ретроспективный анализ и современное состояние проблемы. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2020. T.97, №2. C. 165–173. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-165-173; ISSN0372-9311Men'shikova EA, Kurbatova EM, Titova SV. Ecological features of the persistence of Vibrio cholerae: a retrospective analysis and the current state of the problem. Journal. microbiol., epidemiol. and immunobiol. 2020;97(2):165–173 (in Russ). DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-165-173; ISSN0372-9311.Меньшикова Е. А., Курбатова Е. М., Водопьянов С. О. и др. Оценка способности холерных вибрионов формировать биопленку на поверхности хитинового панциря речного рака. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021. Т. 98, №4. C. 434–439. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-99.Men'shikova EA., Kurbatova EM., Vodop'yanov SO., et al. Evaluation of the ability of cholera vibrios to form a biofilm on the surface of the chitin shell of crayfish. Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology. 2021;98(4):434–439 (in Russ). DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-99.Meibom K.L., Li X.B., Nielsen A.T, et al. The Vibrio cholerae chitin utilization program. Proc. Natl. Acad. ScL USA. 2004. Vol. 101. P. 2524–2529. DOI: 10.1073/pnas.0308707101Meibom KL., Li XB., Nielsen AT, et al. The Vibrio cholerae chitin utilization program. Proc. Natl. Acad. ScL USA. 2004;101:2524–2529. DOI: 10.1073/pnas.0308707101Sinha-Ray S., Ali A. Mutation in flrA and mshA genes of Vibrio cholerae inversely involved in vps – independent biofilm driving bacterium toward nutrients in lake water. Water. Front. Microbiol. 2017. Sec. Aquatic Microbiology. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01770Sinha-Ray S., Ali A. Mutation in flrA and mshA Genes of Vibrio cholerae Inversely Involved in vps-Independent Biofilm Driving Bacterium Toward Nutrients in Lake Water. Water. Front. Microbiol., 2017 Sec. Aquatic Microbiology. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01770Kirn T.J., Jude B.A., Taylor R.K. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection. Nature. 2005. Vol. 438. P. 863–866. DOI: 10.1038/nature04249Kirn TJ., Jude BA., Taylor RK. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection. Nature. 2005; 438: 863–866. DOI: 10.1038/nature04249Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996. Vol. 272. P. 1910–1914. DOI: 10.1126/наука.272.5270.1910Waldor MK., Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996;272:1910–1914. DOI: 10.1126/наука.272.5270.1910Meibom K.L, Blokesch M., Dolganov N.A., et al. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 2005. Vol. 310. P. 1824–1827. DOI: 10.1126/science.1120096Meibom KL, Blokesch M, Dolganov NA., et al. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 2005;310: 1824–1827. DOI: 10.1126/science.1120096Mondal M., Chatterjee N.S. Role of Vibrio cholera exochitinase ChiA2 in horizontal gene transfer Can. J. Microbiol. 2016. Vol. 62, N3 P. 201–209. DOI: 10.1139/cjm-2015-0556Mondal M, Chatterjee NS. Role of Vibrio cholera exochitinase ChiA2 in horizontal gene transfer. Can J. Microbiol. 2016;62(3):201–209. DOI: 10.1139/cjm-2015-0556Metzger LC, Blokesch M. Regulation of competence-mediated horizontal gene transfer in the natural habitat of Vibrio cholera. Curr Open Microbiol. 2016. Vol. 30. P.1–7. DOI: 10.1016/j.mib.2015.10.0070Metzger LC, Blokesch M. Regulation of competence-mediated horizontal gene transfer in the natural habitat of Vibrio cholera. Curr Open Microbiol. 2016;30:1–7. DOI: 10.1016/j.mib.2015.10.0070Worden A.Z., Seidel M., Smriga S., et al. Trophic regulation of Vibrio cholerae in coastal marine waters. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 8. P. 21–29. DOI: https://dx.doi.org/10.1111/j.1462-2920.2005.00863.x)Worden AZ., Seidel M, Smriga S, et al. Trophic regulation of Vibrio cholerae in coastal marine waters. Environ. Microbiol. 2006;8:21–29. DOI: https://dx.doi.org/10.1111/j.1462-2920.2005.00863.xSun S., Tay Q.X.M., Kjelleberg S., et.al. Quorum sensing- regulated chitin metabolism provides grazing resistance to Vibrio cholerae biofilms. The ISME Journal. 2015. Vol. 9, N8. P. 1812–1820. DOI: 10.1038/ismej.2014.265Sun S, Tay QXM., Kjelleberg S, et al. Quorum sensing- regulated chitin metabolism provides grazing resistance to Vibrio cholerae biofilms. The ISME Journal. 2015;9(8):1812–1820. DOI: 10.1038/ismej.2014.265Reguera G., Kolter R. Virulence and the environment: a novel role of Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin. Journal of bacteriology. 2005. Vol. 187, N10. P. 3551–3555. DOI: 10.1128/JB.187.10.3551-3555.2005Reguera G, Kolter R. Virulence and the environment: a novel role of Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin. Journal of bacteriology. 2005;187(10):3551–3555. DOI: 10.1128/JB.187.10.3551-3555.2005Chiavelli D.A., Marsh J. W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67, N7. P 3220–3225. DOI: 10.1128/AEM.67.7.3220-3225.2001Chiavelli DA., Marsh JW., Taylor RK. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2001;67(7):3220–3225. DOI: 10.1128/AEM.67.7.3220-3225.2001Jude B.A., Taylor R.K. The physical basis of type 4 pilus-mediated microcolony formation by Vibrio cholerae O1. J. Struct. Biol. 2011. Vol. 175, N1. P. 1–9. DOI: 10.1016/j.jsb.2011.04.008Jude BA., Taylor RK. The physical basis of type 4 pilus-mediated microcolony formation by Vibrio cholerae O1. J. Struct. Biol. 2011;175(1):1–9. DOI: 10.1016/j.jsb.2011.04.008Окулич В. К., Кабанова А. А., Плотников Ф. В. Микробные биопленки в клинической микробиологии и антибактериальной терапии. Витебск: ВГМУ; 2017. 300 с.: ил. ISBN 978-985-466-896-0Okulich VK., Kabanova AA., Plotnikov FV. Microbial biofilms in clinical microbiology and antibiotic therapy. Vitebsk: VSMU; 2017:300 (in Russ). ISBN 978-985-466-896-0Водопьянов С. О., Водопьянов А. С., Меньшикова Е. А. и др. Способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae O1 серогруппы на поверхности хитина. Патент РФ №2685878; 23.04.2019. Бюл. №12.Vodop'yanov SO, Vodop'yanov AS, Men'shikova EA, Kurbatova EM, Titova SV. A method for modeling biofilms formed by Vibrio cholerae O1 serogroup on the surface of chitin. Patent RUS №2685878; 23.04.2019. Byul. №12 (in Russ).Головин С. Н., Титова С. В. Симонова И. Р. Способ получения образцов биопленок холерных вибрионов для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии. Патент РФ № 2662938; 30.07.2018, Бюл. №22Golovin SN, Titova SV, Simonova IR. Method for obtaining samples of biofilms of cholera vibrios for examination by transmission electron microscopy. Patent RUS № 2662938; 30.07.2018, Byul. №22 (in Russ).Марков Е. Ю., Куликалова B. C., Урбанович Л. Я. и др. Хитин и продукты его гидролиза в экологии Vibrio cholerae. Биохимия. 2015. Т.80, №9. P. 1334–1343. DOI: http://dx.doi.org/10.1134/S0006297915090023Markov EJu, Kulikalova ES, Urbanovich LJa, et al. Chitin and its hydrolysis products in the ecology of Vibrio cholerae. Biocheimiistry. 2015;80(9):1334–1343 (in Russ). DOI: http://dx.doi.org/10.1134/S0006297915090023Дуванова О. В., Мишанькин Б. Н., Водопьянов А. С., Сорокин В. М. N-ацетил-β-D-глюкозаминидаза холерных вибрионов. Журн. микробиол., эпидемиол. ииммунобиол. 2016. Т. 2. С. 41–48. DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-2-41-48Duvanova OV, Mishan'kin BN, Vodop'yanov AS, Sorokin VM. N - acetyl-β-D-glucosaminidase of cholera vibrios. Journal. microbiol., epidemiol. immunobiol. 2016;2:41–48 (in Russ). DOI: https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-2-41-48.Головин С. Н., Симонова И. Р., Титова С. В. и др. Изучение биопленок Vibrio cholerae методом трансмиссионной электронной микроскопии. Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62, №9. С. 568–576. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-63-9-568-576Golovin SN, Simonova IR, Titova SV, et al. The study of Vibrio cholerae biofilms by transmission electron microscopy. Clinical Laboratory Diagnostics. 2017;62(9):568–576 (in Russ). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2017-63-9-568-576Shahkarami M. Vibrio cholerae biofilm development on natural and artificial chitin substrates. 2005. Master’s Theses. 2839. DOI: https://doi.org/10.31979/etd.5478-vxajShahkarami M. Vibrio cholerae biofilm development on natural and artificial chitin substrates. 2005. Master’s Theses. 2839. DOI: https://doi.org/10.31979/etd.5478-vxajNahar S., Sultana M., Naser M.N., et.al. Role of shrimp chitin in the ecology of toxigenic Vibrio cholerae and cholera transmission. Frontiers in Microbiology. 2011. Vol. 2. DOI: https://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2011.00260Nahar S, Sultana M, Naser MN, et al. Role of shrimp chitin in the ecology of toxigenic Vibrio cholerae and cholera transmission. Frontiers in Microbiology. 2011;2. DOI: https://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2011.00260.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.