epidemiologyЭпидемиология и ВакцинопрофилактикаEpidemiology and Vaccinal Prevention2073-30462619-0494«Numicom» LLC10.31631/2073-3046-2024-23-6-54-60epidemiology-2120Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИORIGINAL ARTICLESОптимизация условий сохранения труднокультивируемых экстремально чувствительных к кислороду облигатно-анаэробных бактерий кишечной микробиоты как кандидатов в пробиотические штаммыOptimising Conditions for the Preservation of Extremely Oxygen Sensitive Obligate Anaerobes of the Gut Microbiota as Candidates for Probiotic Strainshttps://orcid.org/0000-0002-8820-9903БембееваБ. О.BembeevaB O.

Байр Очировна Бембеева – научный сотрудник института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии

Москва

+7 (962) 728-21-35

Bayr O. Bembeeva – researcher at the Institute of Microbiology, Antimicrobial Therapy and Epidemiology

Moscow

+7 (962) 728-21-35

b_bembeeva@oparina4.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6224-8202ИсаеваЕ. Л.IsaevaE. L.

Елена Леонидовна Исаева – к. м. н., старший научный сотрудник института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии

Москва

+7 (903) 152-82-79

Elena L. Isaeva – Cand. Sci. (Med.), Senior researcher at the Institute of Microbiology, Antimicrobial Therapy and Epidemiology

Moscow

+7 (903) 152-82-79

isaeva73@bk.ruhttps://orcid.org/0000-0003-0383-0731МуравьеваВ. В.MuravievaV. V.

Вера Васильевна Муравьева – к. б. н., старший научный сотрудник института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии

Москва

+7 (906) 723-72-35

Vera V. Muravieva – Cand. Sci. (Biol.), Senior researcher at the Institute of Microbiology, Antimicrobial Therapy and Epidemiology

Moscow

+7 (906) 723-72-35

ammur14@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6949-5759ЖигаловаК. Н.ZhigalovaK. N.

Ксения Николаевна Жигалова – младший научный сотрудник института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии

Москва

+7 (926) 059-21-19

Kseniya N. Zhigalova – Researcher at the Institute of Microbiology, Antimicrobial Therapy and Epidemiology

Moscow

+7 (926) 059-21-19

ksenya.zhigalova.95@gmail.comhttps://orcid.org/0000-0003-3331-1051НечаеваО. В.NechaevaO. V.

Ольга Викторовна Нечаева – д. б. н., старший научный сотрудник института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии

Москва

+7 (927) 108-11-08

Olga V. Nechaeva – Dr. Sci. (Biol.), Senior researcher at the Institute of Microbiology, Antimicrobial Therapy and Epidemiology

Moscow

+7 (927) 108-11-08

o_nechaeva@oparina4.ruhttps://orcid.org/0009-0006-6059-6258БазухейрД. Х.BazukheyrD. Kh.

Даляль Халед Базухейр – младший научный сотрудник института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии

Москва

+7 (906) 265-25-51

Dalyal Kh. Bazukheyr – junior researcher at the Institute of Microbiology, Antimicrobial Therapy and Epidemiology

Moscow

+7 (906) 265-25-51

d_bazukheyr@oparina4.ruhttps://orcid.org/0000-0002-4126-9730ПрипутневичТ. В.PriputnevichT. V.

Татьяна Валерьевна Припутневич – чл.-корр. РАН, д. м. н., директор института микробиологии, антимикробной терапии и эпидемиологии

Москва

+7 (910) 414-56-16

Tatiana V. Priputnevich – Corresponding Member of Russian Academy of Sciences, Dr. Sci. (Med.), Director of Microbiology, Antimicrobial therapy and Epidemiology Institute

Moscow

+7 (910) 414-56-16

priput1@gmail.comФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава РоссииРоссияNational Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Health of Russian FederationRussian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России; ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава РоссииРоссияNational Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Health of Russian Federation;Russian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава РоссииРоссияNational Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Health of Russian FederationRussian FederationФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России; ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России;РоссияNational Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov of Ministry of Health of Russian Federation; Federal State Autonomous Educational Institution of Higher Education «N.I. Pirogov Russian National Research Medical University» of the Ministry of Health of the Russian Federation; Federal State Budgetary Educational Institution of Further Professional Education "Russian Medical Academy of Continuous Professional Education" of the Ministry of Healthcare of the Russian FederationRussian Federation2024130120252365460Copyright © Бембеева Б.О., Исаева Е.Л., Муравьева В.В., Жигалова К.Н., Нечаева О.В., Базухейр Д.Х., Припутневич Т.В., 20252025Бембеева Б.О., Исаева Е.Л., Муравьева В.В., Жигалова К.Н., Нечаева О.В., Базухейр Д.Х., Припутневич Т.В.Bembeeva B.O., Isaeva E.L., Muravieva V.V., Zhigalova K.N., Nechaeva O.V., Bazukheyr D.K., Priputnevich T.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.epidemvac.ru/jour/article/view/2120

Актуальность. Облигатно-анаэробные труднокультивируемые бактерии, составляющие основную часть микробиоты толстого кишечника, являются потенциальными кандидатами в высокоэффективные пробиотики нового поколения, поскольку способны синтезировать разнообразные метаболиты, в том числе короткоцепочечные жирные кислоты, оказывающие стимулирующее действие как на комменсальные бактерии, так и на клетки макроорганизма. Однако для их длительного сохранения необходимо тщательно подбирать способ консервации и защитные компоненты.Цель. Оценить эффективность использования различных криопротекторов для повышения жизнеспособности труднокультивируемых облигатно-анаэробных бактерий при сохранении методами лиофилизации и криоконсервации.Заключение. Проведенные исследования показали, что лиофильное высушивание в наибольшей степени способствовало сохранению жизнеспособности Faecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes hadrus, Eubacterium hallii при условии использования в качестве стабилизирующей среды, в состав которой входили инулин, цистеин и рибофлавин, обеспечивая сохранение исходного титра бактерий в течение 30 суток. Среди исследуемых бактерий эффективность криоконсерваци была показана для A. hadrus, поскольку обеспечивала выживаемость бактерий на исходном уровне в течение 14 суток хранения вне зависимости от используемого криоконсерванта, однако к 30-м суткам их жизнеспособность значительно снижалась (в 100 раз при использовании в качестве криоконсерванта жидкой питательной среды, в 110 – с рубленым мясом и углеводами с добавлением глицерина, в 10 000 – с коммерческим криоконсервантом CRYOINSTANT). Полученные результаты позволяют рекомендовать лиофилизацию в качестве наиболее оптимального метода длительного хранения пробиотических штаммов бактерий при использовании высокоэффективных стабилизаторов.

Obligate anaerobic difficult culture bacteria, which make up the bulk of the microbiota of the large intestine, are potential candidates for the development of highly effective new generation probiotics, since they are capable of synthesizing a variety of metabolites, including short-chain fatty acids, which have a stimulating effect on both commensal bacteria and host cells. However, for their long-term preservation, it is necessary to carefully select the preservation method and protective components. To evaluate the efficacy of using different cryoprotectants to increase the viability of obligate anaerobic difficult culture bacteria when preserved by lyophilisation and cryopreservation methods. The studies showed that freeze-drying contributed most to the preservation of the viability of Faecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes hadrus, Eubacterium hallii, provided that they were used as a stabilizing medium, which included inulin, cysteine and riboflavin, ensuring the preservation of the initial bacterial titer for 30 days. Among the studied bacteria, the effectiveness of cryopreservation was shown for A. hadrus, since it ensured the survival of bacteria at the initial level for 14 days of storage, regardless of the cryopreservative used, but by the 30th day their viability decreased significantly (by 100 times when using liquid as a cryopreservant). nutrient medium 110 with minced meat and carbohydrates with the addition of glycerin, 10 000 with the commercial cryopreservative CRYOINSTANT). The results obtained allow us to recommend lyophilization as the most optimal method for long-term storage of probiotic strains of bacteria using highly effective stabilizers.

труднокультивируемые бактерииоблигатные анаэробылиофилизациякриоконсервацияпробиотики Конфликт интересов не заявленdifficult culture bacteriaobligate anaerobeslyophilisationcryopreservationprobiotics No conflict of interest to declareReferencesKhan M. T., Van Dijl J. M., Harmsen H. J. M. Antioxidants keep the potentially probiotic but highly oxygen-sensitive human gut bacterium Faecalibacterium prausnitzii alive at ambient air. PLoS One, vol. 9, no. 5, 2014, doi: 10.1371/journal.pone.0096097.Khan M. T., Van Dijl J. M., Harmsen H. J. M. Antioxidants keep the potentially probiotic but highly oxygen-sensitive human gut bacterium Faecalibacterium prausnitzii alive at ambient air. PLoS One, vol. 9, no. 5, 2014, doi: 10.1371/journal.pone.0096097.Goldin B. R. Health benefits of probiotics. Nutr. 1998 Oct;80(4):S203-7. PMID: 9924285.Goldin B. R. Health benefits of probiotics. Nutr. 1998 Oct;80(4):S203-7. PMID: 9924285.Vyas U. and Ranganathan N. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: Gut and beyond. Gastroenterology Research and Practice. 2012. doi: 10.1155/2012/872716.Vyas U. and Ranganathan N. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: Gut and beyond. Gastroenterology Research and Practice. 2012. doi: 10.1155/2012/872716.Gibson G. R. and Roberfroid M. B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, vol. 125. no. 6. 1995. doi: 10.1093/jn/125.6.1401.Gibson G. R. and Roberfroid M. B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, vol. 125. no. 6. 1995. doi: 10.1093/jn/125.6.1401.Gibson G. R., Beatty E. R., Wang X., et al. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. Gastroenterology, vol. 108, no. 4, 1995. doi: 10.1016/0016-5085(95)90192-2.Gibson G. R., Beatty E. R., Wang X., et al. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. Gastroenterology, vol. 108, no. 4, 1995. doi: 10.1016/0016-5085(95)90192-2.Kolida S. and Gibson G. R. Synbiotics in health and disease. Annu Rev Food Sci Technol, vol. 2, 2011. doi: 10.1146/annurev-food-022510-133739.Kolida S. and Gibson G. R. Synbiotics in health and disease. Annu Rev Food Sci Technol, vol. 2, 2011. doi: 10.1146/annurev-food-022510-133739.Mortensen P. B., Clausen M. R. Short-chain fatty acids in the human colon: Relation to gastrointestinal health and disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology, Supplement, vol. 31, no. 216. 1996. doi: 10.3109/00365529609094568.Mortensen P. B., Clausen M. R. Short-chain fatty acids in the human colon: Relation to gastrointestinal health and disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology, Supplement, vol. 31, no. 216. 1996. doi: 10.3109/00365529609094568.Hague A., Singh B., Paraskeva C. Butyrate acts as a survival factor for colonic epithelial cells: Further fuel for the in vivo versus in vitro debate. Gastroenterology, vol. 112, no. 3, 1997, doi: 10.1053/gast.1997.v112.agast971036.Hague A., Singh B., Paraskeva C. Butyrate acts as a survival factor for colonic epithelial cells: Further fuel for the in vivo versus in vitro debate. Gastroenterology, vol. 112, no. 3, 1997, doi: 10.1053/gast.1997.v112.agast971036.Sakata T. Stimulatory effect of short-chain fatty acids on epithelial cell proliferation in the rat intestine: a possible explanation for trophic effects of fermentable fibre, gut microbes and luminal trophic factors. British Journal of Nutrition, vol. 58, no. 1, 1987, doi: 10.1079/bjn19870073.Sakata T. Stimulatory effect of short-chain fatty acids on epithelial cell proliferation in the rat intestine: a possible explanation for trophic effects of fermentable fibre, gut microbes and luminal trophic factors. British Journal of Nutrition, vol. 58, no. 1, 1987, doi: 10.1079/bjn19870073.Shimotoyodome A., Meguro S., Hase T., et al. Decreased colonic mucus in rats with loperamide-induced constipation. Comparative Biochemistry and Physiology - A Molecular and Integrative Physiology, vol. 126, no. 2, 2000, doi: 10.1016/S1095-6433(00)00194-X.Shimotoyodome A., Meguro S., Hase T., et al. Decreased colonic mucus in rats with loperamide-induced constipation. Comparative Biochemistry and Physiology - A Molecular and Integrative Physiology, vol. 126, no. 2, 2000, doi: 10.1016/S1095-6433(00)00194-X.Martín R., Miquel S., Benevides L., et al., Functional characterization of novel Faecalibacterium prausnitzii strains isolated from healthy volunteers: A step forward in the use of F. prausnitzii as a next-generation probiotic. Front Microbiol, vol. 8, no. JUN, 2017, doi: 10.3389/fmicb.2017.01226.Martín R., Miquel S., Benevides L., et al., Functional characterization of novel Faecalibacterium prausnitzii strains isolated from healthy volunteers: A step forward in the use of F. prausnitzii as a next-generation probiotic. Front Microbiol, vol. 8, no. JUN, 2017, doi: 10.3389/fmicb.2017.01226.World Gastroenterology Organisation Global Guidelines Probiotics and prebiotics, 2017.World Gastroenterology Organisation Global Guidelines Probiotics and prebiotics, 2017.Bircher L., Geirnaert A., Hammes F., et al. Effect of cryopreservation and lyophilization on viability and growth of strict anaerobic human gut microbes. Microb Biotechnol, vol. 11, no. 4, 2018, doi: 10.1111/1751-7915.13265.Bircher L., Geirnaert A., Hammes F., et al. Effect of cryopreservation and lyophilization on viability and growth of strict anaerobic human gut microbes. Microb Biotechnol, vol. 11, no. 4, 2018, doi: 10.1111/1751-7915.13265.Malik K. A. Cryopreservation of bacteria with special reference to anaerobes. World J Microbiol Biotechnol, vol. 7, no. 6, 1991, doi: 10.1007/BF00452850.Malik K. A. Cryopreservation of bacteria with special reference to anaerobes. World J Microbiol Biotechnol, vol. 7, no. 6, 1991, doi: 10.1007/BF00452850.Meryman H. T. Cryopreservation of living cells: Principles and practice. Transfusion, vol. 47, no. 5. 2007. doi: 10.1111/j.1537-2995.2007.01212.x.Meryman H. T. Cryopreservation of living cells: Principles and practice. Transfusion, vol. 47, no. 5. 2007. doi: 10.1111/j.1537-2995.2007.01212.x.Broeckx G., Vandenheuvel D., Claes I. J. J., et al. Drying techniques of probiotic bacteria as an important step towards the development of novel pharmabiotics. International Journal of Pharmaceutics, vol. 505, no. 1–2. 2016. doi: 10.1016/j.ijpharm.2016.04.002.Broeckx G., Vandenheuvel D., Claes I. J. J., et al. Drying techniques of probiotic bacteria as an important step towards the development of novel pharmabiotics. International Journal of Pharmaceutics, vol. 505, no. 1–2. 2016. doi: 10.1016/j.ijpharm.2016.04.002.Heylen K., Hoefman S., Vekeman B., et al. Safeguarding bacterial resources promotes biotechnological innovation. Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 94, no. 3. 2012. doi: 10.1007/s00253-011-3797-y.Heylen K., Hoefman S., Vekeman B., et al. Safeguarding bacterial resources promotes biotechnological innovation. Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 94, no. 3. 2012. doi: 10.1007/s00253-011-3797-y.Bellali S., Bou Khalil J., Fontanini A., et al. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiol Res, vol. 236, 2020, doi: 10.1016/j.micres.2020.126454.Bellali S., Bou Khalil J., Fontanini A., et al. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiol Res, vol. 236, 2020, doi: 10.1016/j.micres.2020.126454.de Valdez G. F., de Giori G. S., de Ruiz Holgado A. P., et al. Comparative study of the efficiency of some additives in protecting lactic acid bacteria against freeze-drying. Cryobiology, vol. 20, no. 5, 1983, doi: 10.1016/0011-2240(83)90044-5.de Valdez G. F., de Giori G. S., de Ruiz Holgado A. P., et al. Comparative study of the efficiency of some additives in protecting lactic acid bacteria against freeze-drying. Cryobiology, vol. 20, no. 5, 1983, doi: 10.1016/0011-2240(83)90044-5.Khan M. T., Duncan S. H., Stams A. J. M., et al. The gut anaerobe Faecalibacterium prausnitzii uses an extracellular electron shuttle to grow at oxic-anoxic interphases. ISME Journal, vol. 6, no. 8, 2012, doi: 10.1038/ismej.2012.5.Khan M. T., Duncan S. H., Stams A. J. M., et al. The gut anaerobe Faecalibacterium prausnitzii uses an extracellular electron shuttle to grow at oxic-anoxic interphases. ISME Journal, vol. 6, no. 8, 2012, doi: 10.1038/ismej.2012.5.Neyrinck A.M., Van Hée V.F., Piront N. et al. Wheat-derived arabinoxylan oligosaccharides with prebiotic effect increase satietogenic gut peptides and reduce metabolic endotoxemia in diet-induced obese mice. Nutr Diabetes, vol. 2, no. JANUARY, 2012, doi: 10.1038/nutd.2011.24.Neyrinck A.M., Van Hée V.F., Piront N. et al. Wheat-derived arabinoxylan oligosaccharides with prebiotic effect increase satietogenic gut peptides and reduce metabolic endotoxemia in diet-induced obese mice. Nutr Diabetes, vol. 2, no. JANUARY, 2012, doi: 10.1038/nutd.2011.24.Neyrinck A.M., Possemiers S., Druart C., et al. Prebiotic effects of wheat Arabinoxylan related to the increase in bifidobacteria, roseburia and bacteroides/prevotella in dietinduced obese mice. PLoS One, vol. 6, no. 6, 2011, doi: 10.1371/journal.pone.0020944.Neyrinck A.M., Possemiers S., Druart C., et al. Prebiotic effects of wheat Arabinoxylan related to the increase in bifidobacteria, roseburia and bacteroides/prevotella in dietinduced obese mice. PLoS One, vol. 6, no. 6, 2011, doi: 10.1371/journal.pone.0020944.Gänzle M. G. and Follador R. Metabolism of oligosaccharides and starch in lactobacilli: A review. Frontiers in Microbiology, vol. 3, no. SEP. 2012. doi: 10.3389/fmicb.2012.00340.Gänzle M. G. and Follador R. Metabolism of oligosaccharides and starch in lactobacilli: A review. Frontiers in Microbiology, vol. 3, no. SEP. 2012. doi: 10.3389/fmicb.2012.00340.Baumann D. Preservation of lactic cultures., 1964.Baumann D. Preservation of lactic cultures., 1964.Fowler A. and Toner M. Cryo-injury and biopreservation.. Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1066. 2006. doi: 10.1196/annals.1363.010.Fowler A. and Toner M. Cryo-injury and biopreservation.. Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1066. 2006. doi: 10.1196/annals.1363.010.Leslie S. B., Israeli E., Lighthart B., et al. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during. Appl Environ Microbiol, vol. 61, no. 10, 1995, doi: 10.1128/aem.61.10.3592-3597.1995.Leslie S. B., Israeli E., Lighthart B., et al. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during. Appl Environ Microbiol, vol. 61, no. 10, 1995, doi: 10.1128/aem.61.10.3592-3597.1995.Crowe J. H., Carpenter J. F., Crowe L. M. The role of vitrification in anhydrobiosis. Annual Review of Physiology, vol. 60. 1998. doi: 10.1146/annurev.physiol.60.1.73.Crowe J. H., Carpenter J. F., Crowe L. M. The role of vitrification in anhydrobiosis. Annual Review of Physiology, vol. 60. 1998. doi: 10.1146/annurev.physiol.60.1.73.Бембеева Б.О., Исаева Е.Л., Муравьева В.В. и др. Изучение кишечной микробиоты методом культуромики. Бактериология. 2024; 9(1): 58–62. DOI: 10.20953/2500-1027-2024-1-58-62Bembeeva B.О., Isaeva E.L., Muravieva V.V., et al. Study of intestinal microbiota by culturomics. Bacteriology. 2024; 9(1): 58–62. (In Russ.). DOI: 10.20953/2500-1027-2024-1-58-62 29. https://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium110.pdf

The authors declare that there are no conflicts of interest present.