epidemiologyЭпидемиология и ВакцинопрофилактикаEpidemiology and Vaccinal Prevention2073-30462619-0494«Numicom» LLC10.31631/2073-3046-2024-23-6-114-128epidemiology-2127Research ArticleПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКИPRACTICAL ASPECTS OF EPIDEMIOLOGY AND VACCINE PREVENTIONОптимизация метода выявления единичных копий ДНК вируса гепатита B с помощью систем CRISPR/CasOptimization of a Method for Detecting Single copies of Hepatitis B Virus DNA using CRISPR/Cas systemshttps://orcid.org/0000-0002-3145-3702ТюменцеваМ. А.TyumentsevaM. A.

Марина Алексеевна Тюменцева – к. б. н., заведующая лабораторией геномного редактирования

+7 (495) 974-96-46 (доб. 2627)

Marina A. Tyumentseva – Cand. Sci. (Biol.), Head of the Laboratory of Genome Editing of the OMD&E,

Moscow

+7 (495) 974-96-46 (ext. 2627)

tyumentseva@cmd.suhttps://orcid.org/0000-0003-0537-2586ТюменцевА. И.TyumentsevA. I.

Александр Игоревич Тюменцев – к. б. н., заведующий лабораторией экспериментальной фармакологии ОМДиЭ

Москва

+7 (495) 974-96-46 (доб. 2627)

Aleksandr I. Tyumentsev – Cand. Sci. (Biol.), Head of the Laboratory of Experimental Pharmacology of the OMD&E

Moscow

+7 (495) 974-96-46 (ext. 2627)

tymencev@cmd.suhttps://orcid.org/0000-0002-2471-3844ПреловскаяА. Н.PrelovskayaA. N.

Анна Николаевна Преловская – научный сотрудник лаборатории геномного редактирования ОМДиЭ

Москва

+7 (495) 974-96-46 (доб. 2627)

Anna N. Prelovskaya – researcher at the Laboratory of Genome Editing of the OMD&E

Moscow

+7 (495) 974-96-46 (ext. 2627)

prelovskaya@cmd.suhttps://orcid.org/0000-0003-4228-9044АкимкинВ. Г.AkimkinV. G.

Василий Геннадьевич Акимкин – академик РАН, д. м. н., профессор, директор

Москва

+7 (495) 974-96-46 (доб. 2627)

Vasily G. Akimkin – Academician of the Russian Academy of Sciences, Dr. Sci. (Med.), Professor, Director

Moscow

+7 (495) 974-96-46 (ext. 2627)

akimkin@pcr.msФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» РоспотребнадзораРоссияCentral Research Institute of EpidemiologyRussian Federation202415012025236114128Copyright © Тюменцева М.А., Тюменцев А.И., Преловская А.Н., Акимкин В.Г., 20252025Тюменцева М.А., Тюменцев А.И., Преловская А.Н., Акимкин В.Г.Tyumentseva M.A., Tyumentsev A.I., Prelovskaya A.N., Akimkin V.G.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.epidemvac.ru/jour/article/view/2127

Актуальность. Вирус гепатита B (ВГВ) является этиологическим агентом острого и хронического течения гепатита B у людей. ВОЗ рекомендует использовать чувствительные лабораторные анализы на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для определения ДНК ВГВ. Для ультрачувствительного определения ДНК ВГВ ранее был разработан метод выявления единичных копий ДНК вируса гепатита B с помощью систем CRISPR/Cas.Цель. Оптимизировать метод выявления единичных копий ДНК вируса гепатита B с помощью систем CRISPR/Cas.Материалы и методы. Для получения амплифицированных фрагментов генома ВГВ было разработано 22 олигонуклеотида. Этап предварительной амплификации проводили методом рекомбиназной полимеразной амплификации с использованием разработанных олигонуклеотидов. Получение рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, специфических к фрагментам генома ВГВ, проводили с использованием синтетических направляющих РНК (олигорибонуклеотиды). Этап детекции осуществляли в HOLMES 1.Результаты. При проведении работ по оптимизации метода выявления ДНК ВГВ нам удалось сохранить чувствительность оптимизированного метода на уровне исходного (выявление единичных копий ДНК ВГВ). Кроме того, при проведении оптимизации у нас получилось сократить время, необходимое для проведения анализа. Так, для выявления единичных копий (6 копий в реакции) ДНК ВГВ с помощью исходного метода необходимо 83 минуты, тогда как для оптимизированного – 32 минуты.Заключение. Описанный в статье оптимизированный метод выявления единичных копий ДНК ВГВ с помощью систем CRISPR/Cas в перспективе может быть использован для разработки новых диагностических наборов для выявления ДНК вируса гепатита B, в том числе применимых у постели больного и/или в полевых условиях.

Relevance. Hepatitis B virus (HBV) is the etiologic agent of acute and chronic hepatitis B in humans. WHO recommends the use of sensitive laboratory assays based on nucleic acid amplification methods to detect HBV DNA. A method for detecting single copies of hepatitis B virus DNA using CRISPR/Cas systems was previously developed for ultrasensitive detection of HBV DNA.Aims. The aim of present study was to optimize the method for detecting single copies of hepatitis B virus DNA using CRISPR/Cas systems.Materials and methods. To obtain amplified fragments of the hepatitis B virus genome, 22 oligonucleotides were developed. The preliminary amplification stage was performed by the RPA method using the developed oligonucleotides. The assembly of CRISPR/ Cas ribonucleoprotein complexes specific for fragments of the hepatitis B virus genome was carried out using synthetic guide RNA (oligoribonucleotides). The detection stage was performed in HOLMES 1.Results and discussion. We maintained the sensitivity of the optimized method at the level of the original one (detection of single copies of hepatitis B virus DNA), when optimizing the method for detecting hepatitis B virus DNA. In addition, we reduced the time required for the analysis. Thus, the time required to detect single copies (6 copies per reaction) of hepatitis B virus DNA using the original method is 83 minutes, while for the optimized method it is 32 minutes.Conclusions. The optimized method for detecting single copies of hepatitis B virus DNA using CRISPR/Cas systems described in the article can be used in the future to develop new diagnostic kits, including point-of-care kits and/or kits to use in the field.

вирус гепатита B (ВГВ)ДНКПЦРрекомбиназная полимеразная амплификация (RPA)CRISPR/Casдетекцияhepatitis B virusDNAPCRrecombinase polymerase amplificationCRISPR/CasdetectionReferencesYuen MF, Chen DS, Dusheiko GM, et al. Hepatitis B virus infection. Nat Rev Dis Primers. 2018;4(1):18035. doi:10.1038/nrdp.2018.35Yuen MF, Chen DS, Dusheiko GM, et al. Hepatitis B virus infection. Nat Rev Dis Primers. 2018;4(1):18035. doi:10.1038/nrdp.2018.35Гепатит B. Доступно на: Available at https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b. Ссылка активна на 20 ноября 2024.Gepatit B. Who.int. Accessed November 20, 2024. https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-bFanning GC, Zoulim F, Hou J, Bertoletti A. Therapeutic strategies for hepatitis B virus infection: towards a cure. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(11):827–844. doi:10.1038/s41573-019-0037-0Fanning GC, Zoulim F, Hou J, Bertoletti A. Therapeutic strategies for hepatitis B virus infection: towards a cure. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(11):827–844. doi:10.1038/s41573-019-0037-0Huang DQ, Tran A, Yeh ML, et al. Antiviral therapy substantially reduces HCC risk in patients with chronic hepatitis B infection in the indeterminate phase. Hepatology. 2023;78(5):1558–1568. doi:10.1097/HEP.0000000000000459Huang DQ, Tran A, Yeh ML, et al. Antiviral therapy substantially reduces HCC risk in patients with chronic hepatitis B infection in the indeterminate phase. Hepatology. 2023;78(5):1558–1568. doi:10.1097/HEP.0000000000000459Guidelines on Hepatitis B and C testing. Who.int. Accessed November 20, 2024. https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/254621/9789241549981-eng.pdf;sequence=1Guidelines on Hepatitis B and C testing. Who.int. Accessed November 20, 2024. https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/254621/9789241549981-eng.pdf;sequence=1Gu S, Tao Y, Fan C, et al. Impact of hepatitis B virus point-of-care DNA viral load testing compared with laboratory-based standard-of-care approaches on uptake of HBV viral load testing, treatment, and turnaround times: A systematic review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 2024;11(9):ofae483. doi:10.1093/ofid/ofae483Gu S, Tao Y, Fan C, et al. Impact of hepatitis B virus point-of-care DNA viral load testing compared with laboratory-based standard-of-care approaches on uptake of HBV viral load testing, treatment, and turnaround times: A systematic review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 2024;11(9):ofae483. doi:10.1093/ofid/ofae483Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018;360(6387):436–439. doi:10.1126/science.aar6245Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018;360(6387):436–439. doi:10.1126/science.aar6245Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438–442. doi:10.1126/science.aam9321Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438–442. doi:10.1126/science.aam9321Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439–444. doi:10.1126/science.aaq0179Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439–444. doi:10.1126/science.aaq0179Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018;360(6387):444–448. doi:10.1126/science.aas8836Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018;360(6387):444–448. doi:10.1126/science.aas8836Zhou R, Li Y, Dong T, Tang Y, Li F. A sequence-specific plasmonic loop-mediated isothermal amplification assay with orthogonal color readouts enabled by CRISPR Cas12a. Chem Commun (Camb). 2020;56(24):3536–3538. doi:10.1039/d0cc00397bZhou R, Li Y, Dong T, Tang Y, Li F. A sequence-specific plasmonic loop-mediated isothermal amplification assay with orthogonal color readouts enabled by CRISPR Cas12a. Chem Commun (Camb). 2020;56(24):3536–3538. doi:10.1039/d0cc00397bDing R, Long J, Yuan M, et al. CRISPR/Cas12-based ultra-sensitive and specific point-of-care detection of HBV. Int J Mol Sci. 2021;22(9):4842. doi:10.3390/ijms22094842Ding R, Long J, Yuan M, et al. CRISPR/Cas12-based ultra-sensitive and specific point-of-care detection of HBV. Int J Mol Sci. 2021;22(9):4842. doi:10.3390/ijms22094842Chen X, Tan Y, Wang S, et al. A CRISPR-Cas12b-based platform for ultrasensitive, rapid, and highly specific detection of hepatitis B virus genotypes B and C in clinical application. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:743322. doi:10.3389/fbioe.2021.743322Chen X, Tan Y, Wang S, et al. A CRISPR-Cas12b-based platform for ultrasensitive, rapid, and highly specific detection of hepatitis B virus genotypes B and C in clinical application. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:743322. doi:10.3389/fbioe.2021.743322Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a T rans-cleavage units to facilitate CRISPR diagnostics. Front Microbiol. 2021;12:766464. doi:10.3389/fmicb.2021.766464Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a T rans-cleavage units to facilitate CRISPR diagnostics. Front Microbiol. 2021;12:766464. doi:10.3389/fmicb.2021.766464Тюменцев А.И., Тюменцева М.А., Преловская А.Н., Акимкин В.Г. Система CRISPR-Cas12 для выявления ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях. Патент РФ на изобретение №2782700. 01.11.2022. Бюл. № 31. Доступно на: https://new.fips.ru/ofpstorage/BULLETIN/IZPM/2022/11/10/INDEX_RU.HTM. Ссылка активна на 20 ноября 2024.Tiumentsev AI, Tiumentseva MA, Prelovskaia AN, Akimkin VG. Sistema CRISPR-Cas12 dlya vy`yavleniya DNK virusa gepatita B v ul`tranizkix koncentraciyax. Patent RUS №2782700. 01.11.2022. Byul. № 31. Available at: https://new.fips. ru/ofpstorage/BULLETIN/IZPM/2022/11/10/INDEX_RU.HTM. Accessed: 20 Nov 2024 (In Russ).Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006;4(7):e204. doi:10.1371/journal.pbio.0040204Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006;4(7):e204. doi:10.1371/journal.pbio.0040204Anders C, Jinek M. In vitro enzymology of Cas9. Methods Enzymol. 2014;546:1–20. doi:10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5Anders C, Jinek M. In vitro enzymology of Cas9. Methods Enzymol. 2014;546:1–20. doi:10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5Акимкин В.Г., Тюменцев А.И., Тюменцева М.А. Система CRISPR-Cas для детекции провирусной ДНК ВИЧ. Международный патент WO2021118409A1. 17.06.2021. Доступно на: https://patents.google.com/patent/WO2021118409A1/en?oq=WO2021118409A1. Ссылка активна на 20 ноября 2024.Akimkin VG, Tiumentsev AI, Tiumentseva MA. Crispr/cas system for detecting proviral hiv dna. World Patent WO2021118409A1. 2021 Jun 17. Available at: https://patents.google.com/patent/WO2021118409A1/en?oq=WO2021118409A1. Accessed: 20 Nov 2024 (In Russ).Акимкин В.Г., Тюменцев А.И., Тюменцева М.А. Система CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости. Международный патент WO2021211012A1. 21.10.2021. Доступно на: https://patents.google.com/patent/WO2021211012A1/en?oq=WO2021211012A1. Ссылка активна на 20 ноября 2024.Akimkin VG, Tiumentsev AI, Tiumentseva MA. Crispr/cas system for detecting an antibiotic resistance gene. World Patent WO2021211012A1. 2021 Oct 21. Available at: https://patents.google.com/patent/WO2021211012A1/en?oq=WO2021211012A1. Accessed: 20 Nov 2024. (In Russ).Тюменцев А.И., Тюменцева М.А., Преловская А.Н., Акимкин В.Г. Система CRISPR-CAS14 для выявления РНК вируса Sars-cov-2 в ультранизких концентрациях. Международный патент WO2023055255A1. 06.04.2023. Доступно на: https://patents.google.com/patent/WO2023055255A1/en?oq=WO2023055255A1. Ссылка активна на 20 ноября 2024.Tiumentsev AI, Tiumentseva MA, Prelovskaia AN, Akimkin VG. Crispr-cas14 system for detecting Sars-cov-2 virus rna at ultra-low concentrations. World Patent WO2023055255A1. 2023 Apr 6. Available at: https://patents.google.com/patent/WO2023055255A1/en?oq=WO2023055255A1. Accessed: 20 Nov 2024. (In Russ).Cohen SS. A Guide to Polyamines. Oxford University Press; 1997.Cohen SS. A Guide to Polyamines. Oxford University Press; 1997.Krasnow MA, Cozzarelli NR. Catenation of DNA rings by topoisomerases. Mechanism of control by spermidine. J Biol Chem. 1982;257(5):2687–2693. doi:10.1016/s0021-9258(18)34978-0Krasnow MA, Cozzarelli NR. Catenation of DNA rings by topoisomerases. Mechanism of control by spermidine. J Biol Chem. 1982;257(5):2687–2693. doi:10.1016/s0021-9258(18)34978-0Plateau P, Moch C, Blanquet S. Spermidine strongly increases the fidelity of Escherichia coli CRISPR Cas1-Cas2 integrase. J Biol Chem. 2019;294(29):11311–11322. doi:10.1074/jbc.RA119.007619Plateau P, Moch C, Blanquet S. Spermidine strongly increases the fidelity of Escherichia coli CRISPR Cas1-Cas2 integrase. J Biol Chem. 2019;294(29):11311–11322. doi:10.1074/jbc.RA119.007619Akabayov B, Akabayov SR, Lee SJ, Wagner G, Richardson CC. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nat Commun. 2013;4(1):1615. doi:10.1038/ncomms2620Akabayov B, Akabayov SR, Lee SJ, Wagner G, Richardson CC. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nat Commun. 2013;4(1):1615. doi:10.1038/ncomms2620Minton AP. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. J Biol Chem. 2001;276(14):10577–10580. doi:10.1074/jbc.R100005200Minton AP. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. J Biol Chem. 2001;276(14):10577–10580. doi:10.1074/jbc.R100005200Zimmerman SB, Minton AP. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1993;22(1):27–65. doi:10.1146/annurev.bb.22.060193.000331Zimmerman SB, Minton AP. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1993;22(1):27–65. doi:10.1146/annurev.bb.22.060193.000331Wang Q, Liang KC, Czader A, Waxham MN, Cheung MS. The effect of macromolecular crowding, ionic strength and calcium binding on calmodulin dynamics. PLoS Comput Biol. 2011;7(7):e1002114. doi:10.1371/journal.pcbi.1002114Wang Q, Liang KC, Czader A, Waxham MN, Cheung MS. The effect of macromolecular crowding, ionic strength and calcium binding on calmodulin dynamics. PLoS Comput Biol. 2011;7(7):e1002114. doi:10.1371/journal.pcbi.1002114van den Berg B, Wain R, Dobson CM, Ellis RJ. Macromolecular crowding perturbs protein refolding kinetics: implications for folding inside the cell. EMBO J. 2000;19(15):3870–3875. doi:10.1093/emboj/19.15.3870van den Berg B, Wain R, Dobson CM, Ellis RJ. Macromolecular crowding perturbs protein refolding kinetics: implications for folding inside the cell. EMBO J. 2000;19(15):3870–3875. doi:10.1093/emboj/19.15.3870Sikorav JL, Church GM. Complementary recognition in condensed DNA: accelerated DNA renaturation. J Mol Biol. 1991;222(4):1085–1108. doi:10.1016/0022-2836(91)90595-wSikorav JL, Church GM. Complementary recognition in condensed DNA: accelerated DNA renaturation. J Mol Biol. 1991;222(4):1085–1108. doi:10.1016/0022-2836(91)90595-wAkimkin VG, Tiumentsev AI, Tiumentseva MA, Shagin DA. Method for producing a preparation of highly-purified recombinant cas nuclease. World Patent WO2020197436A1. 2020 Oct 1. Available at: https://patents.google.com/patent/WO2020197436A1/en?oq=WO2020197436A1. Accessed: 20 Nov 2024. (In Russ).Akimkin VG, Tiumentsev AI, Tiumentseva MA, Shagin DA. Method for producing a preparation of highly-purified recombinant cas nuclease. World Patent WO2020197436A1. 2020 Oct 1. Available at: https://patents.google.com/patent/WO2020197436A1/en?oq=WO2020197436A1. Accessed: 20 Nov 2024. (In Russ).Qiu M, Zhou XM, Liu L. Improved strategies for CRISPR-Cas12-based nucleic acids detection. J Anal Test. 2022;6(1):44–52. doi:10.1007/s41664-022-00212-4Qiu M, Zhou XM, Liu L. Improved strategies for CRISPR-Cas12-based nucleic acids detection. J Anal Test. 2022;6(1):44–52. doi:10.1007/s41664-022-00212-4Salehian M, Emamzadeh R, Nazari M, Oliayi M. Glycine as a stabilizing osmolyte for Renilla luciferase: A kinetic and molecular dynamics analysis. Biocatal Biotransformation. Published online 2024:1- 10. doi:10.1080/10242422.2024.2404451Salehian M, Emamzadeh R, Nazari M, Oliayi M. Glycine as a stabilizing osmolyte for Renilla luciferase: A kinetic and molecular dynamics analysis. Biocatal Biotransformation. Published online 2024:1- 10. doi:10.1080/10242422.2024.2404451

The authors declare that there are no conflicts of interest present.