epidemiologyЭпидемиология и ВакцинопрофилактикаEpidemiology and Vaccinal Prevention2073-30462619-0494«Numicom» LLC10.31631/2073-3046-2018-17-3-51-56epidemiology-519Research ArticleОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯORIGINAL ARTICLESЭкспериментальная адаптация вакцинного штамма чумного микроба к процессу лиофилизацииExperimental Adaptation of a strain of the plague microbe to lyophilization processЛопатинаН. В.LopatinaN. V.

к. м. н, ассистент кафедры гигиены

Cand. Sci. (Med.), аssistant of the Department of Hygiene

Natalija.Kozhanova2016@yandex.ruМишанькинБ. Н.MishankinB. N.

д. м. н., профессор, заслуженный деятель науки РФ, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии

Dr. Sci. (Med.), professor, Honored Scientist of the Russian Federation, leading researcher of the laboratory of biochemistry

ФГБОЗ ВО «Ростовский-на-Дону государственный медицинский университет» Минздрава РоссииРоссияRostov State Medical University, Rostov-on-DonRussian FederationФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» РоспотребнадзораРоссияRostov-on-Don anti-plague Institute,Rostov-on-DonRussian Federation2018200620181735156Copyright © Лопатина Н.В., Мишанькин Б.Н., 20182018Лопатина Н.В., Мишанькин Б.Н.Lopatina N.V., Mishankin B.N.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://www.epidemvac.ru/jour/article/view/519

Применение лиофилизации в качестве способа стабилизации свойств живой сухой чумной вакцины сопровождается уменьшением количества микробных клеток Yersinia pestis EV под влиянием испытанного ими стресса. Количество микробных клеток в лиофилизированных живых вакцинах, даже без нарушения режима хранения при низких температурах (4 ± 2 – 6 ± 2 °С), постепенно снижается в результате отмирания живых клеток микроорганизмов, составляющих их основу. Целью настоящей работы стало повышение устойчивости вакцинного штамма. Y. pestis EV линии НИИЭГ к лиофилизации с помощью разных методических подходов: использование самого процесса лиофилизации в качестве селекционирующего фактора; селекция устойчивых клонов из популяций одно-, дву- и трехкратно лиофилизированных культур; культивирование штамма при низких температурах (4 ± 2 – 6 ± 2 °С). Показано, что после повторной и трехкратной лиофилизации, устойчивость штамма Yersinia pestis EV к этому процессу повысилась в 3–3,5 раза. Клональная селекция дважды лиофилизированного варианта способствовала выявлению устойчивых клонов и закреплению у них этого свойства. Экспериментальные серии вакцины, изготовленные на основе селекционированных клонов, обладали повышенной иммуногенностью, высокой термостабильностью и более длительными сроками хранения (в 2–2,3 раза). Получен психрофильный вариант штамма Y. pestis EV 37/28/20/5-exр., который приобрел более высокую устойчивость к лиофилизации, чем референтный. Количество выживших после лиофилизации клеток психрофильного варианта по отношению к коммерческому штамму Y. pestis EV было значительно выше (в 2 и более раз). Таким образом, экспериментально подтверждена возможность получения живой сухой вакцины EV более высокого качества с помощью изложенных в работе способов селекции. Эффективность этих способов создает предпосылки для дальнейшего изучения полученных вариантов Y. pestis EV и возможности их применения в производстве чумной вакцины.

 

The use of lyophilization as a means of preserving commercial properties of the dried live plague vaccine is closely linked to a number ofresistant microbial cells surviving in the preparation after microbial population exposure to such stress action. Lyophilized live vaccine efficiency, even without violation of storage rules at low temperatures (4 ± 2 – 6 ± 2 оС), decreases gradually due to death of live cells of microorganisms forming the base of a vaccine. Aim: The aim of this study was to enhance resistance of the reference vaccine strain Yersinia pestis EV of NIIEG lineage to freeze-drying in vacuum (lyophilization) by different techniques: the use of lyophilization process per se as a selection factor, resistant clone selection from populations of strains which underwent single, double and triple lyophiliation, strain culturing at low temperatures (4 ± 2 – 6 ± 2 °С). Summary and conclusion: It was demonstrated that after double and triple lyophilization the Y. pestis EV strain resistance to the process increased by 3–3.5 times. Clonal selection of twice and three times lyophilized variant facilitated detection of resistant clones and stabilization of this property.The clones selected were characterized by increased immunogenicity, high heat stability, as well as by increased duration of vaccine efficiency (by 2.3 times). A psychrophilic variant of Y. pestis EV strain was obtained in vitro acquiring higher resistance to lyophilization (in 2 times or more) in comparison with the reference strain. The number of psychrophilic variant cells surviving post-liophilization was higher in comparison with the commercial strain. Thus the methods used in this study for selection of strains and clones with the highest resistance to lyophilization from Y. pestis EV reference strain population showed a significant potential for quality improvement of dried live plague vaccine. So, the possibility of receiving of a vaccine of more high quality by means of the ways of selection explained in our work is experimentally confirmed. Effectiveness of these ways creates prerequisites for their use in production of a live plague vaccine.

селекцияштамм Y. pestis EV линии НИИЭГклониммуногенностьтермостабильностьпсихрофильностьselectionstraincloneimmunogenicityheat stabilitypsychrophilityReferencesБухарин О. В., Гинцбург А. Л, Романова Ю. М., Эль-Регистан Г. И. Механизмы выживания бактерий. Москва: Медицина, 2005: 367.Bukharin O. V., Ginzburg A. L., Romanov Y. U., El-Registan G. I. Mechanisms of survival of bacteria. Moscow: Medicine; 2005: 367 (in Russian).Achtman M. Population structure of pathogenic bacteria revisited. Inf. J. Med. Microbiol. 2004; 294 (2): 67–73. DOI: 10.1186/1471-2180-9-50.Achtman M. Population structure of pathogenic bacteria revisited. Inf. J. Med. Microbiol. 2004; 294 (2): 67–73. DOI: 10.1186/1471-2180-9-50.Андрюков Б. Г., Сомова Л. М., Тимченко Н. Ф. Жирные кислоты как объект исследования температурных адаптационных стратегий микроорганизмов-психрофилов. Здоровье, Мед. экология, Наука. 2015; 61 (3): 43–49.Andryukov B. G, Somova L. M, Timtchenko N. F. Fatty acids as an object of study of the temperature-adaptation strategies psychrophiles microorganisms. Zdorovje. Medicinskaya ekologiya. Nauka. [Health. Medical ecology. Science]. 2015; 61 (3): 43–49 (in Russian).Шеремет О. В., КоргановА. Н., Шатова И. Н. Иммуногенность чумного микроба, выращенного на некоторых питательных средах при 28 оС и 37 оС. ЖМЭИ. 1987; 4 (62): 63–68.Sheremet O. V., .Korganov A. N., Shatova I. N. The immunogenicity of the plague microbe, vyraschennogo some nutrient media at 28 ºC and 37 ºC. Zhurnal mikrobiologii, epidemiilogii i immunologii. [Journal of Microbiology Epidemiology and Immunobiology]. 1987; 4 (62): 63 –68 (in Russian).Будыка Д. А., Абзаева Н. В., Гостищева С. Е., Ракитина Е. Л., Иванова Г. И., Фисун А. А. Биотехнология стабилизации живых микроорганизмов в биомассе и в препарате чумной вакцины. Инфекция и иммунитет. 2016; 1 (6): 87–92.Budyka D. A., Abzaeva N. V., Gostischeva S. E., Rakitin E. L., Ivanova G. I., Fisun A. A. Biotehnologiya stabilization of living microorganisms in the biomass and in the preparation of plague vaktsiny. Infektsiya i immunitet. [Russian Journal of Infection and Immunity]. 2016; 1 (6): 87–92 (in Russian).Водопьянов С. О., Кадетов В. В., Олейников И. Л., Мишанькин Б. Н. Различные пути реализации ответа на тепловой и холодовой стресс у Y. pseudotuberculosis и Y. pestis. Биотехнология.1997; 3: 14–17.Vodopianov S. O., Cadets V. V., Oleynikov I. L., Mishankin B. N. Different ways realizatsii response to heat and cold stress at and Y. pseudotuberculosis Y.pestis. Biotehnologya. [Biotekhnology]. 1997; 3: 14–17 (in Russian).Delihas N. Regulating the regulator: MicF RNA controls expression of the global regulator Lrp. Molecular Microbiology 2012; 84: 401–404. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2012.08030.x. PMID: 22380658.Delihas N. Regulating the regulator: MicF RNA controls expression of the global regulator Lrp. Molecular Microbiology 2012; 84: 401–404. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2012.08030.x. PMID: 22380658..КamatsuYa., Kaul SC, Iwahashi Yi, Obuchi K. Do heat shock proteins provide protection against freezing. FEMS Microbiol. Let.1990; 72 (1–2): 159–162.Кamatsu Ya, Kaul SC, Iwahashi Yi, Obuchi K. Do heat shock proteins provide protection against freezing. FEMS Microbiol. Let.1990; 72 (1–2): 159–162.Бренева Н. В., Марамович А. С., Климов В. Т. Экологические закономерности существования патогенных иерсиний в почвенных экосистемах. ЖМЭИ.2005; 6: 82–88.Breneva N. B., Maramovich A. C., Klimov V. T. Environmental regularities jf existence jf pathogenic Yersinia in soil ecosystems. Zhurnal mikrobiologii, epidemiilogii i immunologii. [Journal of Microbiology Epidemiology and Immunobiology]. 2005; 6: 82–88 (in Russian).Абзаева Н. В. Повышение жизнеспособности Y. pestis EV в биомассе вакцины. Дис. ... канд. биол. наук. Ставрополь; 2010: 122.Abzaeva N. V. Improving the viability of Y. pestis EV in biomass vaccine. Doctorate of med. sci. diss. Stavropol; 2010: 122 (in Russian).Иванова Г. Ф., Будыка Д. А., Абзаева Н. В. Сравнительное изучение эффективности противочумных.вакцин, полученных из биомасс, выращенных при температуре (21 ± 1 оС). Сб. науч. трудов. Ставрополь. 2007; 2: 186–188.Ivanova G. F., Budyka D. A., Abzaeva N. V. Comparative study of the efficiency pro¬tivo-chumnyh.vaktsin derived from the biomasses grown at a temperature (21 ± 1) °C. Sbornik nauchnykh trudov. [Collection of scientific papers]. Stavropol. 2007; 2: 186–188 (in Russian).Будыка Д. А., Абзаева Н. В., Гостищева С. Е., Ракитина Е. Л., Иванова Г. Ф., Фисун А. А. Биотехнология стабилизации живых микроорганизмов в биомассе и препарате чумной вакцины. Инфекция и иммунитет. 2016; 6 (1): 87–92.Based on the selected clone 37/28/20/5-ex.Tindall B. J.Vaccuum drying and cryopreservation of prokaryotes. Methods Mol. Biol. 2007; 110: 36–40. DOI: 10. 1007/978-1-597 45-362-2-5.Tindall B. J.Vaccuum drying and cryopreservation of prokaryotes. Methods Mol. Biol. 2007; 110: 36–40. DOI: 10. 1007 / 978-1-597 45-362-2-5.Методика определения термостабильности живых сухих чумных вакцин и прогнозирования их жизнеспособности в процессе хранения. Ставрополь; 1985: 11.The technique of determination of thermal stability of living dry plague vaccines and forecasting their viability during storage, Stavropol, 1985: 11 (in Russian).Ефимова М. П., Петрова Е. В., Румянцев В. Н. Общая теория статистики: Учебник. Москва.:ИНФА-М,2013:416.Efimova M. R., Petrova E. V., Rumyantsev V. N. General theory of statistics:textbook. Moscow. 2013: 416 ( in Russian).Воробьева Л. И., Ходжаев Е. Ю., Новикова Т. М., Мулюкин А. Л., Чудинова Е. М.,Эль-Регистан Г. И. Стрессопротекторное и перекрестное действие внеклеточного реактивирующего фактора микроорганизмов, доменов бактерий, архей и эукариот. Микробиол. 2013; 82 (5): 588. DOI: 10.7868. 5002635613050169.Vorobyova L. I., Khodzhaev E. Y., Novikova T. M., Mulyukin A. L., Chudinov E. M. El Registan G. I. Stressoprotektornoe and cross the action of extracellular reaktiviruyuschego factor microorganisms, bacteria domain archaea and ktery, archaea, and eukaryotes. Mikrobiologia. [Microbiology]. 2013; 82 (5): 588. DOI: 10.7868. 5002635613050169 (in Russian)..Kouda K, Iki M. Beneficial effects of mild stress (hormetic effects): dietary restriction and health. J. Physiol. Anthropol. 2010; 29: 127–132.Kouda K, Iki M. Beneficial effects of mild stress (hormetic effects): dietary restriction and health. J. Physiol. Anthropol. 2010; 29: 127–132.Calabrese EJ, Mattson MP, Calabrese V. Resveratrol commonly displays hormesis: occurrence and biomedical significance. Hum. Exp. Toxicol. 2010; 29: 980–1015.Calabrese EJ, Mattson MP, Calabrese V. Resveratrol commonly displays hormesis: occurrence and biomedical significance. Hum. Exp. Toxicol. 2010; 29: 980–1015.Горячая И. П., Зинченко В. Д., Буряк И. А. Устойчивость мембран дрожжей S. cerevisiae к холодовым воздействиям в условиях окислительного стресса. Науч. ведомости. Серия Естественные науки. 2014; 3 (26): 72–78.Goryachaya I. P., Zinchenko V. D., Buryak I. A. Stability of yeast S. cerevisiae membranes to cold exposures in oxidative stress. Nauchniye vedomosti. Seriya Yestestvenniye nauki.. [Scientific bulletins. Series of Natural Sciences]. 2014; 3 (26): 72–78 (in Russian).Shapiro RS, Cowen LE. Thermal control of Microbial development and virulence: Molecular mechanisms of microbial temperature sensing. MBIO. 2013; 3 (5): 8–12. DOI:10.1128/mBio00238-13.Shapiro RS, Cowen LE. Thermal control of Microbial development and virulence: Molecular mechanisms of microbial temperature sensing.MBIO. 2013; 3 (5): 8–12. DOI: 10.1128/mBio00238-13.Андрюков Б. Г., Сомова Л. М., Тимченко Н. Ф. Жирные кислоты как объект исследования температурно-адаптационных стратегий микроорганизмов-психрофилов.Здоровье, медицинская экология, наука. 2015; 61 (3): 43–49.Andryukov B. G., Somova L. M., Timtchenko N. F. Zhirnye acid as an object of temperature-adaptation strategies-psihrofilov.Zdorove microorganisms meditsinskaya ecology, Nauka. 2015; 61 (3): 43–49 (in Russian).Павлова И. Б.Ленченко Е. М., Кононенко А. Б. Влияние температурного фактора на популяционную изменчивость Yersini. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.2004; 5: 41–44.Pavlova I. B., Lenchenko E. M.,Kononenko A. B. Influence of the temperature factor on population variability Yersini. Reports of the Russian Academy of agricultural sciences.2004; 5: 41 –44 (in Russian).Гендон Ю. З., Маркушин С. Г., Цфасман Т. М., Акопова И. И., Ахматова Н. К., Коптяева И. Б. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопросы вирусологии. 2013; 1 (58): 11–17.Hendon Yu. Z., Markushin S. G., Tsfasman T. M., Akopova I. I., Akhmatova N. K., Koptyaeva I. B. New cold-adapted donor attenuation for live influenza vaccines Voprosi virusologii. [Problems of Virology].2013; 1 (58): 11–17 (in Russian).Цибалова Л. М., Горев М. Е., Потапчук М. В.,Репко И. А., Коротков А. В. и др. Характеристика холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А (Гонконг) 16816235 как потенциального донора аттенуации и высокой продуктивности. Вопросы вирусологии. 2012; 57 (6): 13–17.Tsybalova L. M., Gorev M. E., Potapchuk M. V., Repko I. A., Sergeeva M. V., Korotkov A. D. et al. Characteristics of cold-alapted strains of influenza A virus (Hong Kong) 1/68/162/35 as potential donor of attenuation and high productivity. Voprosi virusologii. [Problems of Virology]. 2012; 57 (6): 13–17 (in Russian).

The authors declare that there are no conflicts of interest present.