Разработка набора реагентов для количественного определения ДНК вируса гепатита B в клиническом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

Актуальность. Гепатит В (ГВ) является одной из наиболее распространенных вирусных инфекций, поражающих людей во всем мире. ГВ может привести к хроническому гепатиту, циррозу и гепатоцеллюлярной карциноме. В настоящее время 3% населения мира инфицированы вирусом гепатита В (ВГВ) и подвержены риску развития опасных для жизни заболеваний печени. На сегодняшний день в лабораторной диагностике обнаружения ВГВ используют иммунологические и молекулярно-биологические методы. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) на сегодняшний день является высокочувствительным методом для обнаружения и количественной оценки содержания вируса гепатита В в организме человека. Количественное определение ДНК ВГВ необходимо для мониторинга эффективности противовирусного лечения инфекции.

Цель. Разработать набор ПЦР в режиме реального времени для количественного определения ДНК ВГВ.

Материалы и методы. В разработке использовано 200 образцов плазмы и сыворотки крови с положительным и отрицательным результатом на ВГВ. Сравнение разрабатываемого набора проводилось с использованием других коммерческих зарегистрированных на территории России наборов по диагностике вируса гепатита B. Дополнительно произведен анализ нуклеотидных последовательностей всех существующих генотипов вируса для подбора праймеров по системе GeneBank.

Результаты и обсуждение. Анализ результатов диагностической чувствительности разрабатываемого набора составляет 100%, специфичность – 100%. Разработанные праймеры были специфично подобраны в области гена POL. Набор способен выявлять все виды генотипов вируса.

Выводы. Разработанный набор реагентов позволяет проводить выявление вируса гепатита В и определять его количество в течение 70 мин. Помимо большого количества генотипов и субгенотипов, вирус характеризуется мутационными изменениями в геноме, что затрудняет его диагностику и, как следствие, проведение адекватной лекарственной терапии. В разработке были учтены консервативные области генома вируса для подбора праймеров и зондов, полученные последовательности применимы ко всем генотипам ВГВ. Набор реагентов разработан для мониторинга ВГВ-инфицированных пациентов и вирусной нагрузки во время проводимого лечения.

1. Гепатит B. Всемирная Организация здравоохранения. Доступно на: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b. Ссылка активна на 24 мая 2023.

2. Вилисова А. Н. Разработка набора реагентов для выявления и количественного определения ДНК вируса гепатита методом полимеразной цепной реакцией. Медицина и фармация, прошлое, настоящее, будущее: IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной Году педагога и наставника; 21 Апреля 2023; Орехово-Зуево, Россия. РИО ГГТУ; 2023. С. 43-47

3. Ganem D., Prince A. M. Hepatitis B Virus Infection – Natural History and Clinical Consequences. New England Journal of Medicine. 2004; Vol. 350, №11. P. 1118–1129.

4. Hu J., Seeger C. Hepadnavirus Genome Replication and Persistence. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2015; Vol. 5, №7. P. 1–16.

5. Venkatakrishnan B., Zlotnick A. The Structural Biology of Hepatitis B Virus: Form and Function. Annual review of virology. 2016; Vol. 3, №1. P. 429–451.

6. Hui L., Junjun C., Usha V., et al. Amino acid residues at core protein dimer-dimer interface modulate multiple steps of hepatitis B virus replication and HBeAg biogenesis. PLoS Pathog. 2021; Vol. 17, №11. P. 1–34.

7. Eren E., Watts N. R., Dearborn A. D., et al. Structures of Hepatitis B Virus Coreand e-Antigen Immune Complexes Suggest Multi-point Inhibition. Structure. 2018; Vol. 26, №10. P. 1314–1326.

8. Selzer L., Zlotnick A. Assembly and Release of Hepatitis B Virus. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2015; Vol.5, №12. P. 1–17.

9. Teng C-F., Wu H-C., Su I-J., et al. Hepatitis B Virus Pre-S Mutants as Biomarkers and Targets for the Development and Recurrence of Hepatocellular Carcinoma. Viruses. 2020; Vol. 12, №9. P. 1–13.

10. Mendenhall M.A., Hong X., Hu J. Hepatitis B Virus Capsid: The Core in Productive Entry and Covalently Closed Circular DNA Formation. Viruses. 2023; Vol.15, №3. P. 1–11.

11. Острый Гепатит B (ГB) у взрослых. Рубрикатор клинических рекомендаций. Доступно на: https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/672_1. Ссылка активна на 24 мая 2023.

12. Зайцев И.А., Новак И.Н., Зайцева О.Е. и др. Значение генотипов вируса гепатита B в клинической практике. Актуальная инфектология. 2019. Т. 7, №2. С. 63–70.

13. ЗАО «ЭКОлаб». Отделение ПЦР-диагностики КовидЭК Экстракт. Доступно по: https://ekolab.ru/catalog/laboratornaya-diagnostik/otdelenie-ptsr/kovidekekstrakt/. Ссылка активна на 24 мая 2023.

14. Basic Local Alignment Search Tool. National Center for Biotechnology Information. Доступно на: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. Ссылка активна на 24 мая 2023.

15. Жигалева О.Н., Марданлы С.Г., Гашенко Т.Ю., и др. Разработка набора реагентов для качественного выявления РНК вируса гепатита С в клиническом материале методом ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Клиническая лабораторная диагностика. 2023; T. 68, №7. С. 437-442.

16. Жигалева О.Н., Марданлы С.Г., Гашенко Т.Ю., и др. Разработка набора реагентов для качественного выявления ДНК Вируса гепатита B (HBV) в клиническом материале методом ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флуоресцентной детекцией. Клиническая лабораторная диагностика. 2023; в печати.