Оптимизация условий сохранения труднокультивируемых экстремально чувствительных к кислороду облигатно-анаэробных бактерий кишечной микробиоты как кандидатов в пробиотические штаммы

Актуальность. Облигатно-анаэробные труднокультивируемые бактерии, составляющие основную часть микробиоты толстого кишечника, являются потенциальными кандидатами в высокоэффективные пробиотики нового поколения, поскольку способны синтезировать разнообразные метаболиты, в том числе короткоцепочечные жирные кислоты, оказывающие стимулирующее действие как на комменсальные бактерии, так и на клетки макроорганизма. Однако для их длительного сохранения необходимо тщательно подбирать способ консервации и защитные компоненты.
Цель. Оценить эффективность использования различных криопротекторов для повышения жизнеспособности труднокультивируемых облигатно-анаэробных бактерий при сохранении методами лиофилизации и криоконсервации.
Заключение. Проведенные исследования показали, что лиофильное высушивание в наибольшей степени способствовало сохранению жизнеспособности Faecalibacterium prausnitzii, Anaerostipes hadrus, Eubacterium hallii при условии использования в качестве стабилизирующей среды, в состав которой входили инулин, цистеин и рибофлавин, обеспечивая сохранение исходного титра бактерий в течение 30 суток. Среди исследуемых бактерий эффективность криоконсерваци была показана для A. hadrus, поскольку обеспечивала выживаемость бактерий на исходном уровне в течение 14 суток хранения вне зависимости от используемого криоконсерванта, однако к 30-м суткам их жизнеспособность значительно снижалась (в 100 раз при использовании в качестве криоконсерванта жидкой питательной среды, в 110 – с рубленым мясом и углеводами с добавлением глицерина, в 10 000 – с коммерческим криоконсервантом CRYOINSTANT). Полученные результаты позволяют рекомендовать лиофилизацию в качестве наиболее оптимального метода длительного хранения пробиотических штаммов бактерий при использовании высокоэффективных стабилизаторов.

1. Khan M. T., Van Dijl J. M., Harmsen H. J. M. Antioxidants keep the potentially probiotic but highly oxygen-sensitive human gut bacterium Faecalibacterium prausnitzii alive at ambient air. PLoS One, vol. 9, no. 5, 2014, doi: 10.1371/journal.pone.0096097.

2. Goldin B. R. Health benefits of probiotics. Nutr. 1998 Oct;80(4):S203-7. PMID: 9924285.

3. Vyas U. and Ranganathan N. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: Gut and beyond. Gastroenterology Research and Practice. 2012. doi: 10.1155/2012/872716.

4. Gibson G. R. and Roberfroid M. B. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics. Journal of Nutrition, vol. 125. no. 6. 1995. doi: 10.1093/jn/125.6.1401.

5. Gibson G. R., Beatty E. R., Wang X., et al. Selective stimulation of bifidobacteria in the human colon by oligofructose and inulin. Gastroenterology, vol. 108, no. 4, 1995. doi: 10.1016/0016-5085(95)90192-2.

6. Kolida S. and Gibson G. R. Synbiotics in health and disease. Annu Rev Food Sci Technol, vol. 2, 2011. doi: 10.1146/annurev-food-022510-133739.

7. Mortensen P. B., Clausen M. R. Short-chain fatty acids in the human colon: Relation to gastrointestinal health and disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology, Supplement, vol. 31, no. 216. 1996. doi: 10.3109/00365529609094568.

8. Hague A., Singh B., Paraskeva C. Butyrate acts as a survival factor for colonic epithelial cells: Further fuel for the in vivo versus in vitro debate. Gastroenterology, vol. 112, no. 3, 1997, doi: 10.1053/gast.1997.v112.agast971036.

9. Sakata T. Stimulatory effect of short-chain fatty acids on epithelial cell proliferation in the rat intestine: a possible explanation for trophic effects of fermentable fibre, gut microbes and luminal trophic factors. British Journal of Nutrition, vol. 58, no. 1, 1987, doi: 10.1079/bjn19870073.

10. Shimotoyodome A., Meguro S., Hase T., et al. Decreased colonic mucus in rats with loperamide-induced constipation. Comparative Biochemistry and Physiology - A Molecular and Integrative Physiology, vol. 126, no. 2, 2000, doi: 10.1016/S1095-6433(00)00194-X.

11. Martín R., Miquel S., Benevides L., et al., Functional characterization of novel Faecalibacterium prausnitzii strains isolated from healthy volunteers: A step forward in the use of F. prausnitzii as a next-generation probiotic. Front Microbiol, vol. 8, no. JUN, 2017, doi: 10.3389/fmicb.2017.01226.

12. World Gastroenterology Organisation Global Guidelines Probiotics and prebiotics, 2017.

13. Bircher L., Geirnaert A., Hammes F., et al. Effect of cryopreservation and lyophilization on viability and growth of strict anaerobic human gut microbes. Microb Biotechnol, vol. 11, no. 4, 2018, doi: 10.1111/1751-7915.13265.

14. Malik K. A. Cryopreservation of bacteria with special reference to anaerobes. World J Microbiol Biotechnol, vol. 7, no. 6, 1991, doi: 10.1007/BF00452850.

15. Meryman H. T. Cryopreservation of living cells: Principles and practice. Transfusion, vol. 47, no. 5. 2007. doi: 10.1111/j.1537-2995.2007.01212.x.

16. Broeckx G., Vandenheuvel D., Claes I. J. J., et al. Drying techniques of probiotic bacteria as an important step towards the development of novel pharmabiotics. International Journal of Pharmaceutics, vol. 505, no. 1–2. 2016. doi: 10.1016/j.ijpharm.2016.04.002.

17. Heylen K., Hoefman S., Vekeman B., et al. Safeguarding bacterial resources promotes biotechnological innovation. Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 94, no. 3. 2012. doi: 10.1007/s00253-011-3797-y.

18. Bellali S., Bou Khalil J., Fontanini A., et al. A new protectant medium preserving bacterial viability after freeze drying. Microbiol Res, vol. 236, 2020, doi: 10.1016/j.micres.2020.126454.

19. de Valdez G. F., de Giori G. S., de Ruiz Holgado A. P., et al. Comparative study of the efficiency of some additives in protecting lactic acid bacteria against freeze-drying. Cryobiology, vol. 20, no. 5, 1983, doi: 10.1016/0011-2240(83)90044-5.

20. Khan M. T., Duncan S. H., Stams A. J. M., et al. The gut anaerobe Faecalibacterium prausnitzii uses an extracellular electron shuttle to grow at oxic-anoxic interphases. ISME Journal, vol. 6, no. 8, 2012, doi: 10.1038/ismej.2012.5.

21. Neyrinck A.M., Van Hée V.F., Piront N. et al. Wheat-derived arabinoxylan oligosaccharides with prebiotic effect increase satietogenic gut peptides and reduce metabolic endotoxemia in diet-induced obese mice. Nutr Diabetes, vol. 2, no. JANUARY, 2012, doi: 10.1038/nutd.2011.24.

22. Neyrinck A.M., Possemiers S., Druart C., et al. Prebiotic effects of wheat Arabinoxylan related to the increase in bifidobacteria, roseburia and bacteroides/prevotella in dietinduced obese mice. PLoS One, vol. 6, no. 6, 2011, doi: 10.1371/journal.pone.0020944.

23. Gänzle M. G. and Follador R. Metabolism of oligosaccharides and starch in lactobacilli: A review. Frontiers in Microbiology, vol. 3, no. SEP. 2012. doi: 10.3389/fmicb.2012.00340.

24. Baumann D. Preservation of lactic cultures., 1964.

25. Fowler A. and Toner M. Cryo-injury and biopreservation.. Annals of the New York Academy of Sciences, vol. 1066. 2006. doi: 10.1196/annals.1363.010.

26. Leslie S. B., Israeli E., Lighthart B., et al. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during. Appl Environ Microbiol, vol. 61, no. 10, 1995, doi: 10.1128/aem.61.10.3592-3597.1995.

27. Crowe J. H., Carpenter J. F., Crowe L. M. The role of vitrification in anhydrobiosis. Annual Review of Physiology, vol. 60. 1998. doi: 10.1146/annurev.physiol.60.1.73.

28. Бембеева Б.О., Исаева Е.Л., Муравьева В.В. и др. Изучение кишечной микробиоты методом культуромики. Бактериология. 2024; 9(1): 58–62. DOI: 10.20953/2500-1027-2024-1-58-62