Оптимизация метода выявления единичных копий ДНК вируса гепатита B с помощью систем CRISPR/Cas

Актуальность. Вирус гепатита B (ВГВ) является этиологическим агентом острого и хронического течения гепатита B у людей. ВОЗ рекомендует использовать чувствительные лабораторные анализы на основе методов амплификации нуклеиновых кислот для определения ДНК ВГВ. Для ультрачувствительного определения ДНК ВГВ ранее был разработан метод выявления единичных копий ДНК вируса гепатита B с помощью систем CRISPR/Cas.
Цель. Оптимизировать метод выявления единичных копий ДНК вируса гепатита B с помощью систем CRISPR/Cas.
Материалы и методы. Для получения амплифицированных фрагментов генома ВГВ было разработано 22 олигонуклеотида. Этап предварительной амплификации проводили методом рекомбиназной полимеразной амплификации с использованием разработанных олигонуклеотидов. Получение рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, специфических к фрагментам генома ВГВ, проводили с использованием синтетических направляющих РНК (олигорибонуклеотиды). Этап детекции осуществляли в HOLMES 1.
Результаты. При проведении работ по оптимизации метода выявления ДНК ВГВ нам удалось сохранить чувствительность оптимизированного метода на уровне исходного (выявление единичных копий ДНК ВГВ). Кроме того, при проведении оптимизации у нас получилось сократить время, необходимое для проведения анализа. Так, для выявления единичных копий (6 копий в реакции) ДНК ВГВ с помощью исходного метода необходимо 83 минуты, тогда как для оптимизированного – 32 минуты.
Заключение. Описанный в статье оптимизированный метод выявления единичных копий ДНК ВГВ с помощью систем CRISPR/Cas в перспективе может быть использован для разработки новых диагностических наборов для выявления ДНК вируса гепатита B, в том числе применимых у постели больного и/или в полевых условиях.

1. Yuen MF, Chen DS, Dusheiko GM, et al. Hepatitis B virus infection. Nat Rev Dis Primers. 2018;4(1):18035. doi:10.1038/nrdp.2018.35

2. Гепатит B. Доступно на: Available at https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b. Ссылка активна на 20 ноября 2024.

3. Fanning GC, Zoulim F, Hou J, Bertoletti A. Therapeutic strategies for hepatitis B virus infection: towards a cure. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(11):827–844. doi:10.1038/s41573-019-0037-0

4. Huang DQ, Tran A, Yeh ML, et al. Antiviral therapy substantially reduces HCC risk in patients with chronic hepatitis B infection in the indeterminate phase. Hepatology. 2023;78(5):1558–1568. doi:10.1097/HEP.0000000000000459

5. Guidelines on Hepatitis B and C testing. Who.int. Accessed November 20, 2024. https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/254621/9789241549981-eng.pdf;sequence=1

6. Gu S, Tao Y, Fan C, et al. Impact of hepatitis B virus point-of-care DNA viral load testing compared with laboratory-based standard-of-care approaches on uptake of HBV viral load testing, treatment, and turnaround times: A systematic review and meta-analysis. Open Forum Infect Dis. 2024;11(9):ofae483. doi:10.1093/ofid/ofae483

7. Chen JS, Ma E, Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018;360(6387):436–439. doi:10.1126/science.aar6245

8. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017;356(6336):438–442. doi:10.1126/science.aam9321

9. Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, Joung J, Collins JJ, Zhang F. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018;360(6387):439–444. doi:10.1126/science.aaq0179

10. Myhrvold C, Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018;360(6387):444–448. doi:10.1126/science.aas8836

11. Zhou R, Li Y, Dong T, Tang Y, Li F. A sequence-specific plasmonic loop-mediated isothermal amplification assay with orthogonal color readouts enabled by CRISPR Cas12a. Chem Commun (Camb). 2020;56(24):3536–3538. doi:10.1039/d0cc00397b

12. Ding R, Long J, Yuan M, et al. CRISPR/Cas12-based ultra-sensitive and specific point-of-care detection of HBV. Int J Mol Sci. 2021;22(9):4842. doi:10.3390/ijms22094842

13. Chen X, Tan Y, Wang S, et al. A CRISPR-Cas12b-based platform for ultrasensitive, rapid, and highly specific detection of hepatitis B virus genotypes B and C in clinical application. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:743322. doi:10.3389/fbioe.2021.743322

14. Lv H, Wang J, Zhang J, et al. Definition of CRISPR Cas12a T rans-cleavage units to facilitate CRISPR diagnostics. Front Microbiol. 2021;12:766464. doi:10.3389/fmicb.2021.766464

15. Тюменцев А.И., Тюменцева М.А., Преловская А.Н., Акимкин В.Г. Система CRISPR-Cas12 для выявления ДНК вируса гепатита B в ультранизких концентрациях. Патент РФ на изобретение №2782700. 01.11.2022. Бюл. № 31. Доступно на: https://new.fips.ru/ofpstorage/BULLETIN/IZPM/2022/11/10/INDEX_RU.HTM. Ссылка активна на 20 ноября 2024.

16. Piepenburg O, Williams CH, Stemple DL, Armes NA. DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol. 2006;4(7):e204. doi:10.1371/journal.pbio.0040204

17. Anders C, Jinek M. In vitro enzymology of Cas9. Methods Enzymol. 2014;546:1–20. doi:10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5

18. Акимкин В.Г., Тюменцев А.И., Тюменцева М.А. Система CRISPR-Cas для детекции провирусной ДНК ВИЧ. Международный патент WO2021118409A1. 17.06.2021. Доступно на: https://patents.google.com/patent/WO2021118409A1/en?oq=WO2021118409A1. Ссылка активна на 20 ноября 2024.

19. Акимкин В.Г., Тюменцев А.И., Тюменцева М.А. Система CRISPR-Cas для выявления гена антибиотикоустойчивости. Международный патент WO2021211012A1. 21.10.2021. Доступно на: https://patents.google.com/patent/WO2021211012A1/en?oq=WO2021211012A1. Ссылка активна на 20 ноября 2024.

20. Тюменцев А.И., Тюменцева М.А., Преловская А.Н., Акимкин В.Г. Система CRISPR-CAS14 для выявления РНК вируса Sars-cov-2 в ультранизких концентрациях. Международный патент WO2023055255A1. 06.04.2023. Доступно на: https://patents.google.com/patent/WO2023055255A1/en?oq=WO2023055255A1. Ссылка активна на 20 ноября 2024.

21. Cohen SS. A Guide to Polyamines. Oxford University Press; 1997.

22. Krasnow MA, Cozzarelli NR. Catenation of DNA rings by topoisomerases. Mechanism of control by spermidine. J Biol Chem. 1982;257(5):2687–2693. doi:10.1016/s0021-9258(18)34978-0

23. Plateau P, Moch C, Blanquet S. Spermidine strongly increases the fidelity of Escherichia coli CRISPR Cas1-Cas2 integrase. J Biol Chem. 2019;294(29):11311–11322. doi:10.1074/jbc.RA119.007619

24. Akabayov B, Akabayov SR, Lee SJ, Wagner G, Richardson CC. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nat Commun. 2013;4(1):1615. doi:10.1038/ncomms2620

25. Minton AP. The influence of macromolecular crowding and macromolecular confinement on biochemical reactions in physiological media. J Biol Chem. 2001;276(14):10577–10580. doi:10.1074/jbc.R100005200

26. Zimmerman SB, Minton AP. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 1993;22(1):27–65. doi:10.1146/annurev.bb.22.060193.000331

27. Wang Q, Liang KC, Czader A, Waxham MN, Cheung MS. The effect of macromolecular crowding, ionic strength and calcium binding on calmodulin dynamics. PLoS Comput Biol. 2011;7(7):e1002114. doi:10.1371/journal.pcbi.1002114

28. van den Berg B, Wain R, Dobson CM, Ellis RJ. Macromolecular crowding perturbs protein refolding kinetics: implications for folding inside the cell. EMBO J. 2000;19(15):3870–3875. doi:10.1093/emboj/19.15.3870

29. Sikorav JL, Church GM. Complementary recognition in condensed DNA: accelerated DNA renaturation. J Mol Biol. 1991;222(4):1085–1108. doi:10.1016/0022-2836(91)90595-w

30. Akimkin VG, Tiumentsev AI, Tiumentseva MA, Shagin DA. Method for producing a preparation of highly-purified recombinant cas nuclease. World Patent WO2020197436A1. 2020 Oct 1. Available at: https://patents.google.com/patent/WO2020197436A1/en?oq=WO2020197436A1. Accessed: 20 Nov 2024. (In Russ).

31. Qiu M, Zhou XM, Liu L. Improved strategies for CRISPR-Cas12-based nucleic acids detection. J Anal Test. 2022;6(1):44–52. doi:10.1007/s41664-022-00212-4

32. Salehian M, Emamzadeh R, Nazari M, Oliayi M. Glycine as a stabilizing osmolyte for Renilla luciferase: A kinetic and molecular dynamics analysis. Biocatal Biotransformation. Published online 2024:1- 10. doi:10.1080/10242422.2024.2404451