Экспериментальная адаптация вакцинного штамма чумного микроба к процессу лиофилизации

Применение лиофилизации в качестве способа стабилизации свойств живой сухой чумной вакцины сопровождается уменьшением количества микробных клеток Yersinia pestis EV под влиянием испытанного ими стресса. Количество микробных клеток в лиофилизированных живых вакцинах, даже без нарушения режима хранения при низких температурах (4 ± 2 – 6 ± 2 °С), постепенно снижается в результате отмирания живых клеток микроорганизмов, составляющих их основу. Целью настоящей работы стало повышение устойчивости вакцинного штамма. Y. pestis EV линии НИИЭГ к лиофилизации с помощью разных методических подходов: использование самого процесса лиофилизации в качестве селекционирующего фактора; селекция устойчивых клонов из популяций одно-, дву- и трехкратно лиофилизированных культур; культивирование штамма при низких температурах (4 ± 2 – 6 ± 2 °С). Показано, что после повторной и трехкратной лиофилизации, устойчивость штамма Yersinia pestis EV к этому процессу повысилась в 3–3,5 раза. Клональная селекция дважды лиофилизированного варианта способствовала выявлению устойчивых клонов и закреплению у них этого свойства. Экспериментальные серии вакцины, изготовленные на основе селекционированных клонов, обладали повышенной иммуногенностью, высокой термостабильностью и более длительными сроками хранения (в 2–2,3 раза). Получен психрофильный вариант штамма Y. pestis EV 37/28/20/5-exр., который приобрел более высокую устойчивость к лиофилизации, чем референтный. Количество выживших после лиофилизации клеток психрофильного варианта по отношению к коммерческому штамму Y. pestis EV было значительно выше (в 2 и более раз). Таким образом, экспериментально подтверждена возможность получения живой сухой вакцины EV более высокого качества с помощью изложенных в работе способов селекции. Эффективность этих способов создает предпосылки для дальнейшего изучения полученных вариантов Y. pestis EV и возможности их применения в производстве чумной вакцины.

1. Бухарин О. В., Гинцбург А. Л, Романова Ю. М., Эль-Регистан Г. И. Механизмы выживания бактерий. Москва: Медицина, 2005: 367.

2. Achtman M. Population structure of pathogenic bacteria revisited. Inf. J. Med. Microbiol. 2004; 294 (2): 67–73. DOI: 10.1186/1471-2180-9-50.

3. Андрюков Б. Г., Сомова Л. М., Тимченко Н. Ф. Жирные кислоты как объект исследования температурных адаптационных стратегий микроорганизмов-психрофилов. Здоровье, Мед. экология, Наука. 2015; 61 (3): 43–49.

4. Шеремет О. В., КоргановА. Н., Шатова И. Н. Иммуногенность чумного микроба, выращенного на некоторых питательных средах при 28 оС и 37 оС. ЖМЭИ. 1987; 4 (62): 63–68.

5. Будыка Д. А., Абзаева Н. В., Гостищева С. Е., Ракитина Е. Л., Иванова Г. И., Фисун А. А. Биотехнология стабилизации живых микроорганизмов в биомассе и в препарате чумной вакцины. Инфекция и иммунитет. 2016; 1 (6): 87–92.

6. Водопьянов С. О., Кадетов В. В., Олейников И. Л., Мишанькин Б. Н. Различные пути реализации ответа на тепловой и холодовой стресс у Y. pseudotuberculosis и Y. pestis. Биотехнология.1997; 3: 14–17.

7. Delihas N. Regulating the regulator: MicF RNA controls expression of the global regulator Lrp. Molecular Microbiology 2012; 84: 401–404. DOI: 10.1111/j.1365-2958.2012.08030.x. PMID: 22380658.

8. КamatsuYa., Kaul SC, Iwahashi Yi, Obuchi K. Do heat shock proteins provide protection against freezing. FEMS Microbiol. Let.1990; 72 (1–2): 159–162.

9. Бренева Н. В., Марамович А. С., Климов В. Т. Экологические закономерности существования патогенных иерсиний в почвенных экосистемах. ЖМЭИ.2005; 6: 82–88.

10. Абзаева Н. В. Повышение жизнеспособности Y. pestis EV в биомассе вакцины. Дис. ... канд. биол. наук. Ставрополь; 2010: 122.

11. Иванова Г. Ф., Будыка Д. А., Абзаева Н. В. Сравнительное изучение эффективности противочумных.вакцин, полученных из биомасс, выращенных при температуре (21 ± 1 оС). Сб. науч. трудов. Ставрополь. 2007; 2: 186–188.

12. Будыка Д. А., Абзаева Н. В., Гостищева С. Е., Ракитина Е. Л., Иванова Г. Ф., Фисун А. А. Биотехнология стабилизации живых микроорганизмов в биомассе и препарате чумной вакцины. Инфекция и иммунитет. 2016; 6 (1): 87–92.

13. Tindall B. J.Vaccuum drying and cryopreservation of prokaryotes. Methods Mol. Biol. 2007; 110: 36–40. DOI: 10. 1007/978-1-597 45-362-2-5.

14. Методика определения термостабильности живых сухих чумных вакцин и прогнозирования их жизнеспособности в процессе хранения. Ставрополь; 1985: 11.

15. Ефимова М. П., Петрова Е. В., Румянцев В. Н. Общая теория статистики: Учебник. Москва.:ИНФА-М,2013:416.

16. Воробьева Л. И., Ходжаев Е. Ю., Новикова Т. М., Мулюкин А. Л., Чудинова Е. М.,Эль-Регистан Г. И. Стрессопротекторное и перекрестное действие внеклеточного реактивирующего фактора микроорганизмов, доменов бактерий, архей и эукариот. Микробиол. 2013; 82 (5): 588. DOI: 10.7868. 5002635613050169.

17. Kouda K, Iki M. Beneficial effects of mild stress (hormetic effects): dietary restriction and health. J. Physiol. Anthropol. 2010; 29: 127–132.

18. Calabrese EJ, Mattson MP, Calabrese V. Resveratrol commonly displays hormesis: occurrence and biomedical significance. Hum. Exp. Toxicol. 2010; 29: 980–1015.

19. Горячая И. П., Зинченко В. Д., Буряк И. А. Устойчивость мембран дрожжей S. cerevisiae к холодовым воздействиям в условиях окислительного стресса. Науч. ведомости. Серия Естественные науки. 2014; 3 (26): 72–78.

20. Shapiro RS, Cowen LE. Thermal control of Microbial development and virulence: Molecular mechanisms of microbial temperature sensing. MBIO. 2013; 3 (5): 8–12. DOI:10.1128/mBio00238-13.

21. Андрюков Б. Г., Сомова Л. М., Тимченко Н. Ф. Жирные кислоты как объект исследования температурно-адаптационных стратегий микроорганизмов-психрофилов.Здоровье, медицинская экология, наука. 2015; 61 (3): 43–49.

22. Павлова И. Б.Ленченко Е. М., Кононенко А. Б. Влияние температурного фактора на популяционную изменчивость Yersini. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук.2004; 5: 41–44.

23. Гендон Ю. З., Маркушин С. Г., Цфасман Т. М., Акопова И. И., Ахматова Н. К., Коптяева И. Б. Новые холодоадаптированные штаммы-доноры аттенуации для живых вакцин против гриппа. Вопросы вирусологии. 2013; 1 (58): 11–17.

24. Цибалова Л. М., Горев М. Е., Потапчук М. В.,Репко И. А., Коротков А. В. и др. Характеристика холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А (Гонконг) 16816235 как потенциального донора аттенуации и высокой продуктивности. Вопросы вирусологии. 2012; 57 (6): 13–17.