Трансмиссионная электронная микроскопия биопленок Vibrio cholerae на хитин-содержащих субстратах

Актуальность. Эволюционно сложившаяся ассоциация Vibrio cholerae с хитином обеспечила устойчивость к стрессовым воздействиям и защиту от хищников. Образование биопленки служит важнейшим механизмом создания эффективной ассоциации холерного вибриона с хитином. Способность формировать биопленку у V. cholerae зависит от наличия токсинкоррегулируемых пилей адгезии (TCP), за синтез которых отвечают гены tcp A-F. Одним из ключевых методов исследования биопленок является микроскопия. Она позволяет визуализировать структурные элементы и изучать различные параметры биопленок и эффекты воздействия на них различных факторов. Цель. Определение эпидзначимости биопленкообразующей способности токсигенных штаммов по их морфологическим особенностям на хитин-содержащих субстратах. Изучение структурных различий биопленок холерных вибрионов tcpA+ и tcpA– штаммов на хитин-содержащих субстратах. Материалы и методы. В исследовании использованы штаммы холерных вибрионов, разные по токсигенности и происхождению. В своей работе мы применили трансмиссионную электронную микроскопию для оценки эпидзначимости процесса биопленкообразования V. cholerae на хитин-содержащих субстратах. Результаты. Показано, что холерные вибрионы tcpA+ и tcpA– штаммов способны образовывать биопленки на поверхности хитин-содержащих субстратов. Интенсивность образования биопленок более выражена у tcpA+ штаммов, т.к. клетки V. cholerae ctxA+ tcpA+ в составе биопленки располагаются преимущественно одиночно и поверхность хитинового экзоскелета, с которой они контактируют, интактна, клетки V. cholerae ctxA– tcpA– в составе биопленки образуют цепочки, что указывает на процессы деления, а разрозненный хитин эндокутикулы свидетельствует об активности метаболических процессов. Заключение. Используемые в работе штаммы V. cholerae, независимо от наличия или отсутствия генов ctx и tcp, образуют биопленки на хитиновом субстрате. Показатель биопленкообразования по толщине матрикса биопленки выше у V. cholerae ctxA+ tcpA+ , по степени деградации хитинового субстрата выше у V. cholerae ctxA– tcpA– . Холерные вибрионы, имеющие ген tcpA, обладают большей интенсивностью биопленкообразования, что, в свою очередь, указывает на эпидемическую значимость феномена биопленкообразования и свидетельствует о важной роли хитина для персистенции холерных вибрионов в условиях гидробиоценозов водоемов и возможности выживания и сохранения эпидемически значимых штаммов.

1. Silva A.J., Benitez J.A. Vibrio cholerae biofilms and cholera pathogenesis // PLOS Neglected Tropical Diseases. 2016. Vol. 10, N2. https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0004330

2. Rahman H., Mahbub K.R., Vergara G.E., et al. Protozoal food vacuoles enhance transformation in Vibrio cholerae through SOS-regulated DNA integration // The ISME Journal. 2022. Vol. 16. Р. 1993-2001. https://doi.org/10.1038/s41396-022-01249-0

3. Pruzzo C., Vezzulli L, Colwell R.R. Global impact Vibrio cholerae interactions with chitin // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10. P. 1400-1410. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2007.01559.x

4. Vezzulli L, Guzman C.A., Colwell R.R., Pruzzo C. Dual role colonization factors connecting Vibrio cholerae’s lifestyles in human and aquatic environments open new perspectives for combating infectious diseases // Curr. Opin. Biotechnol. 2008. Vol. 19. https://doi.org/10.1016/j.copbio.2008.04.002

5. Vezzullia L., Grandea C., Reidb P.C., et al. Climate influence on Vibrio and associated human diseases during the past half-century in the coastal North Atlantic. Proc Natl Acad Sci USA. 2016. Vol. 23, N113(34). P 5062-5071. https://doi.org/10.1073/pnas.1609157113

6. Меньшикова Е. А., Курбатова Е. М., Титова С. В. Экологические особенности персистенции холерных вибрионов: ретроспективный анализ и современное состояние проблемы. Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2020. T.97, №2. C. 165-173. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-2-165-173; ISSN0372-9311

7. Меньшикова Е. А., Курбатова Е. М., Водопьянов С. О. и др. Оценка способности холерных вибрионов формировать биопленку на поверхности хитинового панциря речного рака. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2021. Т. 98, №4. C. 434-439. https://doi.org/10.36233/0372-9311-99.

8. Meibom K.L., Li X.B., Nielsen A.T, et al. The Vibrio cholerae chitin utilization program. Proc. Natl. Acad. ScL USA. 2004. Vol. 101. P. 2524-2529. https://doi.org/10.1073/pnas.0308707101

9. Sinha-Ray S., Ali A. Mutation in flrA and mshA genes of Vibrio cholerae inversely involved in vps - independent biofilm driving bacterium toward nutrients in lake water. Water. Front. Microbiol. 2017. Sec. Aquatic Microbiology. https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.01770

10. Kirn T.J., Jude B.A., Taylor R.K. A colonization factor links Vibrio cholerae environmental survival and human infection. Nature. 2005. Vol. 438. P. 863-866. https://doi.org/10.1038/nature04249

11. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin. Science. 1996. Vol. 272. P. 1910-1914. https://doi.org/10.1126/наука.272.5270.1910

12. Meibom K.L, Blokesch M., Dolganov N.A., et al. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 2005. Vol. 310. P. 1824-1827. https://doi.org/10.1126/science.1120096

13. Mondal M., Chatterjee N.S. Role of Vibrio cholera exochitinase ChiA2 in horizontal gene transfer Can. J. Microbiol. 2016. Vol. 62, N3 P. 201-209. https://doi.org/10.1139/cjm-2015-0556

14. Metzger LC, Blokesch M. Regulation of competence-mediated horizontal gene transfer in the natural habitat of Vibrio cholera. Curr Open Microbiol. 2016. Vol. 30. P.1-7. https://doi.org/10.1016/j.mib.2015.10.0070

15. Worden A.Z., Seidel M., Smriga S., et al. Trophic regulation of Vibrio cholerae in coastal marine waters. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 8. P. 21-29. https://doi.org/10.1111/j.1462-2920.2005.00863.x)

16. Sun S., Tay Q.X.M., Kjelleberg S., et.al. Quorum sensing- regulated chitin metabolism provides grazing resistance to Vibrio cholerae biofilms. The ISME Journal. 2015. Vol. 9, N8. P. 1812-1820. https://doi.org/10.1038/ismej.2014.265

17. Reguera G., Kolter R. Virulence and the environment: a novel role of Vibrio cholerae toxin-coregulated pili in biofilm formation on chitin. Journal of bacteriology. 2005. Vol. 187, N10. P. 3551-3555. https://doi.org/10.1128/JB.187.10.3551-3555.2005

18. Chiavelli D.A., Marsh J. W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton. Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67, N7. P 3220-3225. https://doi.org/10.1128/AEM.67.7.3220-3225.2001

19. Jude B.A., Taylor R.K. The physical basis of type 4 pilus-mediated microcolony formation by Vibrio cholerae O1. J. Struct. Biol. 2011. Vol. 175, N1. P. 1-9. https://doi.org/10.1016/j.jsb.2011.04.008

20. Окулич В. К., Кабанова А. А., Плотников Ф. В. Микробные биопленки в клинической микробиологии и антибактериальной терапии. Витебск: ВГМУ; 2017. 300 с.: ил. ISBN 978-985-466-896-0

21. Водопьянов С. О., Водопьянов А. С., Меньшикова Е. А. и др. Способ моделирования биопленок, формируемых Vibrio cholerae O1 серогруппы на поверхности хитина. Патент РФ №2685878; 23.04.2019. Бюл. №12.

22. Головин С. Н., Титова С. В. Симонова И. Р. Способ получения образцов биопленок холерных вибрионов для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии. Патент РФ № 2662938; 30.07.2018, Бюл. №22

23. Марков Е. Ю., Куликалова B. C., Урбанович Л. Я. и др. Хитин и продукты его гидролиза в экологии Vibrio cholerae. Биохимия. 2015. Т.80, №9. P. 1334-1343. https://doi.org/10.1134/S0006297915090023

24. Дуванова О. В., Мишанькин Б. Н., Водопьянов А. С., Сорокин В. М. N-ацетил-β-D-глюкозаминидаза холерных вибрионов. Журн. микробиол., эпидемиол. ииммунобиол. 2016. Т. 2. С. 41-48. https://doi.org/10.36233/0372-9311-2016-2-41-48

25. Головин С. Н., Симонова И. Р., Титова С. В. и др. Изучение биопленок Vibrio cholerae методом трансмиссионной электронной микроскопии. Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62, №9. С. 568-576. https://doi.org/10.18821/0869-2084-2017-63-9-568-576

26. Shahkarami M. Vibrio cholerae biofilm development on natural and artificial chitin substrates. 2005. Master’s Theses. 2839. https://doi.org/10.31979/etd.5478-vxaj

27. Nahar S., Sultana M., Naser M.N., et.al. Role of shrimp chitin in the ecology of toxigenic Vibrio cholerae and cholera transmission. Frontiers in Microbiology. 2011. Vol. 2. https://doi.org/10.3389/fmicb.2011.00260