Синергический эффект ферментных препаратов и гентамицина на биоплёнки Bordetella pertussis

Актуальность. Рост заболеваемости коклюшем, высокий удельный вес тяжёлых форм заболевания, снижение чувствительности циркулирующих штаммов B. pertussis к антибиотикам требуют разработки более эффективных средств этиотропной терапии, в том числе способных влиять на биоплёночные формы возбудителя коклюша, отличающихся от планктонных клеток повышенной устойчивостью к иммунной системе хозяина и антибактериальным препаратам.

Цель. Изучение влияния трипсина и лидазы в сочетании с гентамицином на рост биоплёнок штаммов Bordetella pertussis на абиотическом субстрате.

Материалы и методы. В опытах использовали выделенные в РФ от больных коклюшем в 2001–2010 гг. штаммы B. pertussis: № 178 (серовар 1.2.0), № 287 (серовар1.0.3) и № 317 (серовар 1.2.3), выращенные на плотной питательной среде. Интенсивность образования биоплёнок в жидкой питательной среде в присутствии трипсина (10 мкг/мл), лидазы (20 МЕ/мл), гентамицина (2,0 мг/мл, 0,4 мг/мл и 0,08 мг/мл) и их сочетаний в круглодонных полистироловых 96­луночных планшетах оценивали окрашиванием 0,1% раствором генциан­фиолетового.

Результаты. Гентамицин частично подавлял формирование биоплёнок и вызывал частичное разрушение сформированных биоплёнок при отсутствии роста микробных колоний при посеве надосадочных жидкостей из биоплёночных культур на плотную питательную среду. Минимальная подавляющая концентрация гентамицина (МПК) составила 2 мг/мл. Трипсин полностью подавлял рост биоплёнок и вызывал полное разрушение сформированных биоплёнок. Лидаза также подавляла рост биоплёнок, однако менее эффективно влияла на сформированные биоплёнки. При посеве надосадочных жидкостей из биоплёночных культур в присутствии трипсина и лидазы на плотную питательную среду был отмечен рост типичных для B. pertussis колоний. Трипсин в сочетании со всеми исследованными концентрациями гентамицина полностью подавлял рост биоплёнок (МПК 0,08 мг/мл), а в сочетании с гентамицином в концентрации 2,0 мг/мл вызывал полное разрушении биоплёнок при отсутствии микробного роста на плотной питательной среде. Лидаза в сочетании со всеми исследованными концентрациями гентамицина также подавляла формирование биоплёнок (МПК 0,08 мг/мл), а в сочетании с гентамицином в концентрации 2,0 мг/мл  вызывала частичное разрушение сформированных биоплёнок при отсутствии микробного роста на плотной питательной среде.

Заключение. Выявлен синергический эффект комбинаций трипсина и лидазы с гентамицином на растущие и сформированные биоплёнки штаммов B. pertussis. Совместное использование трипсина или лидазы с гентамицином позволило снизить его МПК для растущих биоплёнок в 25 раз. Наиболее выраженным эффектом в отношении сформированных биоплёнок отличалась комбинация трипсина с гентамицином в концентрации 2 мг/мл, вызывавшая их полное разрушение и гибель планктонных клеток. Эффект комбинации лидазы с гентамицином на сформированные биоплёнки был менее выраженным.

1. Ломоносова А. В. Причины и последствия несвоевременной вакцинации против коклюшной инфекции в Российской Федерации. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2020 Т. 97, №5. С. 492–502. DOI:https://doi.org/10.36233/0372-9311-2020-97-5-11.

2. Yeung K.H.T., Duclos P., Nelson E.A.S., et al. An update of the global burden of pertussis in children younger than 5 years: a modelling study. Lancet Infect. Dis . 2017;1(9):974– 980. doi: 10.1016/S1473-3099(17)30390-0.

3. Fullen A.R, Yount K.S, Dubey P., et al. Whoop! There it is: The surprising resurgence of pertussis. PLoS Pathog. 2020;16(7):1008625. doi:10.1371/journal.ppat.1008625.

4. Борисова О. Ю., Алешкин А. В., Ивашинникова Г. А. и др. Чувствительность штаммов Bordetella pertussis к антибактериальным препаратам. Детские инфекции. 2013 № 2. С. 46–50.

5. Cattelan N., Dubey P., Arnal L., et al. Bordetella biofilms: a lifestyle leading to persistent infections. Pathog. Dis. 2016;74(1):ftv 108. DOI: 10.1093/femspd/ftv108.

6. Wille J., Coenye T. Biofilm dispersion: The key to biofilm eradication or opening Pandora’s box? Biofilm. 2020;2:100027. DOI: 10.1016/j.bioflm.2020.100027.

7. МУК 4.2.2317-08 Отбор, проверка и хранение производственных штаммов коклюшных, паракоклюшных и бронхисептикозных бактерий. Москва. 2009.

8. Зайцев Е. М., Брицина М. В., Озерецковская М. Н. и др. Культивирование биопленок Bordetella pertussis на абиотическом субстрате. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019 № 1. С. 49–53. DOI:10.36233/0372-9311-2019-1-49-53.

9. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград. 1962.

10. Liu H., Chen H. , Sun Y., et al. Characterization of the mechanism and impact of staphylokinase on the formation of Candida albicans and Staphylococcus aureus polymicrobial biofilms. J. Med. Microbiol. 2019;68(3):355–367. doi:10.1099/jmm.0.000914].

11. Manoharan A., Das T., Whiteley G.S., et al. The effect of N-acetylcysteine in a combined antibiofilm treatment against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus. J. Antimicrob. Chemother. 2020;75(7):1787–1798. doi: 10.1093/jac/dkaa093.

12. Fleming D., Rumbaugh K. The Consequences of Biofilm Dispersal on the Host. Sci Rep. 2018;8(1):10738. doi: 10.1038/s41598-018-29121-2.

13. Pirlar R.F., Emaneini M., Beigverdi R., et al. Combinatorial effects of antibiotics and enzymes against dual-species Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms in the wound-like medium. PLoS One. 2020;15(6):0235093. doi: 10.1371/journal.pone.0235093.

14. Poilvache H., Ruiz-Sorribas A., Cornu O., et al. In Vitro Study of the Synergistic Effect of an Enzyme Cocktail and Antibiotics against Biofilms in a Prosthetic Joint Infection Model. Antimicrob. Agents Chemother. 2021;65(4):01699–20. doi: 10.1128/AAC.01699–20.

15. Shukla S.K., Rao T.S. Staphylococcus aureus biofilm removal by targeting biofilm-associated extracellular proteins. Indian J. Med. Res. 2017;146 (Supplement):S1–S8. doi: 10.4103/ijmr.IJMR_410_15/.

16. Tetz G.V., Artemenko N.A., Tetz V.V. Effect of DNase and antibiotics on biofilm characteristics. Antimicrob. Agents. Chemother. 2009;53(3):1204–1209. doi:10.1128/AAC.00471-08.